Nei rettili, i lipidi della pelle da conspecifici sono cruciali per segnalazione sessuale, con uso potenziale nella gestione di specie invasive. Qui, descriviamo i protocolli per l’estrazione dei lipidi della pelle da pelle capannone o animali interi, determinare e analizzare la massa totale del lipido che separa i lipidi mediante frazionamento via colonna cromatografia.
Rettili segnalano conspecifici utilizzo di lipidi nella loro pelle, principalmente per consentire compagno di monitoraggio e valutazione. L’isolamento di questi lipidi ha utilità nella ricerca focalizzata su percorsi evolutivi e i meccanismi di comunicazione chimica, oltre a comprendere il ruolo d’impermeabilizzazione dei lipidi nell’evoluzione della vita terrestre. In un approccio applicato, tali spunti basati su pelle avere uso potenziale per i gestori di fauna selvatica a che fare con le specie invasive. I principali passaggi per quantificare i lipidi della pelle di rettile nel protocollo presentato qui includono l’estrazione, determinazione del lipido totale e frazionamento tramite cromatografia su colonna, il processo di quest’ultimo conseguente purificati eluati di composti che possono quindi o essere analizzati per assegnare composti identificazioni (ad es., gas cromatografia spettrometria di massa [GC-MS]) e/o utilizzato direttamente nelle analisi biologiche più raffinate. I lipidi della pelle può essere estratta da pelle viva, della pelle, o morto tutto animali, utilizzando solventi organici non polari (ad es., esano, benzene, toluene) della tettoia. Estrazione solubilizza i lipidi e, quindi, il solvente può essere volatilizzato per produrre un estratto lipido-solo misurabile. Frazionamento comporta la separazione dell’estratto lipidico totale in eluati specifici tramite tradizionale cromatografia su colonna. L’estratto lipidico totale prima è associato a una colonna basata su substrato (ad es., allumina) e, quindi, eluati individuali (“frazioni”) di solvente a volumi specifici sono passati in sequenza attraverso la colonna per eluire set composti da una miscela di lipidi Basato su polarità comune. I progressi di frazioni in polarità durante una sequenza standardizzata aumentando la relativa quantità di solvente polare (per esempio, etere etilico) in solventi non polari. In questo manoscritto, descriviamo i diversi metodi per l’estrazione dei lipidi della pelle dei rettili e, quindi, fornire un protocollo standard per l’isolamento di diversi gruppi di composti a base di polarità, mediante cromatografia su colonna tradizionale. Estratti lipido intero o frazioni specifiche possono, quindi, essere utilizzate nelle analisi biologiche per determinare qualsiasi attività biologica suscitata dai composti in esso.
Rettili producono lipidi nell’epidermide, direttamente da cellule della pelle o da ghiandole discrete che vengono usate nella comunicazione sociale, come compagno valutazione e monitoraggio, territorialità e intra – e interspecifiche riconoscimento1,2 ,3,4. L’isolamento di questi lipidi della pelle ha programma di utilità di ricerca focalizzato su percorsi evolutivi e meccanismi di comunicazione chimica, oltre a comprendere il ruolo d’impermeabilizzazione dei lipidi nell’evoluzione della vita terrestre2,3 ,4. Ulteriormente, molti rettili, soprattutto degli Squamati (lucertole, serpenti), sono specie invasive in ecosistemi sensibili, e lo sviluppo di esche feromone-based per migliorare l’intrappolamento e la rimozione in corso5,6. L’impermeabilità della pelle del rettile facilita l’estrazione dei lipidi presenti e ottenere estrazioni relativamente pure di una fonte potenzialmente robusta di segnali chimici. I passaggi di principio per quantificare i lipidi della pelle di rettile nel protocollo descritto includono l’estrazione, determinazione del lipido totale e frazionamento via colonna cromatografia1,6,7. I metodi sono stati utilizzati ordinariamente come cedono bioattivi isolati che spiegano molto circa la scelta e selezione, soprattutto in serpenti2.
I lipidi della pelle possono essere estratti da pelle viva, pelle capannone, o rettili morti interi, utilizzando non polari o solventi organici polari1,7,8,9. Dovrebbe essere notato che esemplari conservati in solventi come etanolo non sono ottimali per l’estrazione dei lipidi della pelle, e carcasse solo fresche o congelate fresco dovrebbero essere considerate come possibili fonti per l’estrazione. I lipidi della pelle sono inerti, che li rende stabile sulla superficie della pelle e facile da estrarre7. Nei loro ruoli di segnalazione in ecologia del rettile, stecche del lipido della pelle spesso sono depositati in ambienti difficili, ma a causa delle loro proprietà chimiche robusto, tali indicazioni possono conservano il loro valore di informazioni per lunghi periodi di tempo10,11 , 12. il processo di estrazione solubilizza i lipidi, utilizzando un solvente non polare (ad es., esano, benzene, toluene) sopra un ore di ammollo, seguita dall’evaporazione del solvente, per lasciare una massa misurabile di lipido estratto7 , 8. i lipidi della pelle sono altamente miscibili in solventi non polari, e una vasta gamma di idrocarburi può essere estratta da una gamma Analogamente diversificata di fonti.
Frazionamento è più laborioso rispetto estrazione ma serve a separare l’estratto lipidico totale in frazioni specifiche tramite cromatografia a colonna, per facilitare la purificazione e la possibile identificazione dei composti ivi1, 6 , 7 , 8. l’estratto lipidico totale è associato a una colonna basata su substrato, e quindi, eluati individuali (“frazioni”) di solvente a volumi specifici sono passati in sequenza attraverso la colonna per eluire set composti da una miscela di lipidi che hanno una comune polarità6,7,8. Nella cromatografia del lipido, i progressi di frazioni in polarità ad alcuni standardizzato sequenza aumentando la relativa quantità di solvente polare (per esempio, etere etilico) in solventi non polari (in genere espressa in percentuale: 0%, 2%, 4% etere, ecc. )6,7,8. Anche se i metodi come cromatografia di strato sottile (TLC) può essere utilizzato per separare i lipidi in una miscela e sono più semplice, cromatografia a colonna è preferito perché utilizza un sistema chiuso, è facile da controllare, può separata più concentrato miscele ed è compatibile con multiplexing per efficienza. In questo manoscritto, descriviamo i diversi metodi per l’estrazione dei lipidi della pelle dei rettili e, quindi, fornire un protocollo standard per l’isolamento di diversi gruppi di composti a base di polarità, mediante cromatografia su colonna tradizionale. In molti progetti di ricerca che coinvolgono l’isolamento dei segnali chimici, l’obiettivo finale è per ottenere un cambiamento nei ricevitori esposti a quei segnali. Estratti lipido intero o frazioni specifiche possono, quindi, essere utilizzate nelle analisi biologiche per determinare che qualsiasi attività biologica ha suscitato dai composti ivi1,2,6,7. Nella ricerca biologica di base, per esempio, le analisi biologiche utilizzando frazioni specifiche possono rivelare ai ricercatori che una fonte purificata di feromoni è stata isolata, e quindi, metodi per l’identificazione dei composti bersaglio possono essere perseguiti. Da una prospettiva di gestione della fauna selvatica, identificazione non può essere l’obiettivo, e invece, la frazione attiva potrebbe essere utilizzata nel campo per ottenere conspecifici di trappole o inibire compagno di rilevamento in habitat non nativi13,14.
L’estrazione dei lipidi della pelle nei rettili può essere applicato alla pelle vivere o morta, oltre a pelle capannone, che offre versatilità nell’applicazione sperimentale di questa tecnica. Ulteriormente, le estrazioni di lipidi della pelle possono essere fatto in campo, per attivare un’applicazione dinamica del metodo ad una vasta gamma di biologi2,13. Estrazione dei lipidi della pelle è semplice; Pertanto, è facile da scalare le estrazioni come necessario per ogni esperimento o progettazione e significativa esperienza per eseguire i metodi non hanno bisogno i professionisti. La disponibilità di spazio cappa fumi, un’abbondanza di vetro pulito, sigillabile e spazio di immagazzinaggio solvente sono gli unici fattori limitanti per la scalabilità.
Frazionamento di estratto lipidico della pelle può essere adattata alle esigenze di un ricercatore e, pertanto, ha flessibilità simile all’estrazione dei lipidi. Ad esempio, lipidi neutri possono essere eluiti e poi scartati, per provocare le frazioni di destinazione che possono purificare composti di interesse o semplificare le analisi biologiche. Frazionamento può essere eseguito a scale multiple all’interno e tra i campioni del lipido. Ad esempio, più colonne possono essere eseguite simultaneamente per rendere il processo più efficiente. In alternativa, solo una parte di un estratto lipidico totale può essere frazionata su una piccola colonna a, quindi, risparmiare i reagenti ed il tempo. Frazionamento è limitato principalmente dalla massa dell’estratto lipidico totale e la precisione delle apparecchiature disponibili al ricercatore. Ad esempio, se il ricercatore ha un equilibrio con una precisione di 10,0 mg, la determinazione della frazione di massa e, di conseguenza, la precisione della preparazione del campione per l’analisi GC-MS è significativamente, se non completamente, ostacolata. Lo stesso vale per la vetreria. Se il ricercatore ha una colonna di grande volume per frazionamento, ma ha una massa di piccoli lipidico totale per separare, l’eluizione o la separazione dei composti progredirà ma richiederà un significativo spreco di solventi, reagenti, tempo e, potenzialmente, la destinazione composti di se stessi.
Si consiglia di eseguire un controllo di qualità prima di determinare il regime di eluizione, come si vede nella tabella 2e decidere quali frazioni possono essere scartate. Per confermare l’eluizione dei lipidi desiderati, una colonna possono essere dove ogni frazione, 1-15, è raccolti singolarmente e poi analizzati tramite GC-MS. Nella Figura 3, rappresentante gascromatografo tracce mostrano che chetoni di metile da serpenti giarrettiera eluire solo dalla colonna in una frazione di specifica. Eseguendo questo passaggio di controllo di qualità, un regime di eluizione modificate possa essere sviluppato per una data specie garantire la massima resa dei composti di interesse. Modifiche nei materiali, ad esempio il fornitore o il sacco dell’allumina o l’età dell’etere dietilico, assolutamente si tradurrà in differenze di eluizione che dovrebbe essere controllato per eseguendo un test di controllo qualità.
Le tecniche descritte sono limitate principalmente dalla natura chimica dei segnali che possono essere ottenuti. Principalmente, questi metodi solo permettono ai ricercatori di isolare e separare i lipidi catena lunga dalla pelle di rettili. Molte specie di rettili utilizzano segnali nell’aria e/o proteici come segnali chimici, e i metodi descritti sono incompatibili con isolamento cues ha detto. Più ulteriormente, non polare solventi non estrarre acquose spunti dalle superfici dei rettili o fonti di deposizione di cue (ad es., acqua di gabbia, materia fecale, substrato acquatica) che possono effettivamente contenere abbondanti segnali chimici. Metodi appropriati per l’acquisizione di questi tipi di segnali sono disponibili ai ricercatori (ad es., fase solida microextraction [SPME] per volatili spunti e cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC] per stecche acquose), anche se, come i metodi descritto sopra, c’è una curva di apprendimento tecnica.
La cosa più importante, l’utilità della miscela chimica finale al ricercatore dovrebbe guidare i metodi utilizzati. Ad esempio, se un ricercatore vuole sapere se un animale maschio focale possibile distinguere tra le stecche prodotte da uomo vs donna conspecifici in un’analisi biologica mirata, l’estrazione è che l’unico metodo necessari2,3. Se l’obiettivo è l’identificazione di composti sessualmente dimorphic, tuttavia, l’Estratto dovrebbe essere purificato, per consentire una maggiore fiducia nell’assegnazione di identificazioni a specifiche molecole o gruppi di molecole tramite analisi chimica1, 6,9,11. Tuttavia, per condurre anche cromatografia con una fonte di lipidi, una massa significativa di avviamento estratto è necessaria affinché masse misurabili frazione possono essere ottenute; in caso contrario, la messa in comune dei campioni può essere perseguito, ma non è ottimale14.
Futuri sviluppi del presente protocollo comprendono misure per utilizzare e adattare la procedura per le specie più rettile. Ulteriori metodi non invasivi di estrazione di lipidi della pelle sono anche in fase di sviluppo.
The authors have nothing to disclose.
Lo sviluppo di questi metodi, soprattutto capannone estrazione di lipidi della pelle, si è verificato durante accordi di cooperazione (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA e 16-7412-1269-CA) tra James Madison University (JMU) e animale di l’US Department of Agriculture e Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P riconosce i contributi degli studenti seguenti allo sviluppo dei metodi pelle capannone: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zanetti (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) e S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |