Summary

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Published: May 11, 2019
doi:

Summary

Basato sull’ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati “test” e “controllo”, questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Abstract

Il controllo genico della citoarchitettura neuronale è attualmente oggetto di indagini intensive. Descritto qui è un metodo semplice sviluppato per studiare il controllo genico in vivo della morfologia del neurone di proiezione neocorticale. Questo metodo si basa su (1) ingegneria lentivirale in vitro di precursori neuronali come cellule “test” e “controllo”, (2) il loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e (3) la valutazione morfometrica associata dei loro derivati neuronali. In particolare, a questo scopo vengono utilizzati precursori palliali E12.5 provenienti da donatori panneuronali, geneticamente etichettati. Sono progettati per sfruttare i promotori selezionati e la tecnologia tetON/OFF, e vengono trapiantati a mano libera in ventricoli laterali neoalari. Successivamente, al momento della profilazione immunofluorescenza dei cervelli riceventi, le sagome dei neuroni trapiantati vengono inserite nel software open source NeurphologyJ, vengono estratti i loro parametri morfometrici e vengono calcolati i dati di lunghezza e diramazione medici. Rispetto ad altri metodi, questo offre tre vantaggi principali: permette di ottenere un controllo fine dell’espressione transgenica a costi accessibili, richiede solo competenze chirurgiche di base e fornisce risultati statisticamente affidabili dopo l’analisi di un numero di animali. A causa del suo design, tuttavia, non è sufficiente affrontare il controllo non autonomo delle cellule della neuroarchitettura. Inoltre, dovrebbe essere preferibilmente usato per studiare il controllo della morfologia neurite dopo il completamento della migrazione neuronale. Nella sua formulazione attuale, questo metodo è squisitamente sintonizzato per studiare il controllo genetico dell’architettura neocorticale glutamatergica. Approfittando delle linee transgeniche che esprimono EGFP in altri tipi specifici di cellule neurali, può essere riutilizzato per affrontare il controllo genico della loro architettura.

Introduction

Qui descriviamo un semplice metodo che abbiamo sviluppato per sezionare il controllo genico in vivo della citoarchitettura neuronale. Basato sull’ingegneria in vitro dei precursori neuronali, il loro trapianto nel cervello neonale e la valutazione morfometrica accoppiata delle cellule “test” e “controllo”, permette di svelare implicazioni funzionali dei geni di prova nel controllo fine della morfologia neuronale in un modo veloce e conveniente. Per studiare il controllo genico in vivo dell’architettura neuronale, devono essere affrontate tre questioni tecniche chiave: (1) ottenere un’espressione gene of-interest (GOI) adeguatamente modellata e un controllo quantitativo accurato di essa; (2) ottenere una visualizzazione adeguatamente segmentata di sagome neuronali distinte; (3) suscitare un significato statistico dei risultati, impiegando un numero limitato di animali.

Quando disponibile, le linee mutanti di topo che ospitano transgeni controllati da tetraciclina (tet) possono essere lo strumento migliore per affrontare il primo numero1. In alternativa, può essere impiegata la transgenesi somatica. In questi casi, il transgene viene consegnato tramite elettroporazione2 o trasduzione virale3. Successivamente, viene mantenuto come esoma (ad esempio, su elettroporazione standard4), oppure è integrato nel genoma (casualmente, tramite integrasi retrovirale5; o in una posizione definita, tramite la ricombinazione omologa promossa da CRISPR (SLENDR)6 ).

In secondo luogo, la visualizzazione della silhouette neuronale può essere ottenuta tramite (a) etichettatura uniforme sparsa o (b) etichettatura differenziale densa. Per quanto riguarda l’etichettatura sparse, le metodologie avanzate simili a Golgi possono essere impiegate7, i miniset neuronali selezionati possono essere riempiti dalla biocitina8e l’etichettatura sale e pepe può essere ottenuta grazie a un transgene scarsamente espresso. Tale transgene può visualizzare la trascrizione variegata (Thy-EGFP)9 o può essere attivato da ricombinazione stocastica (MORF)10. Per quanto riguarda (b), le strategie all’avanguardia includono la ricombinazione stocastica mediata da Cre nell’ambito di un array transgene di fluoroproteina multi-floscio (Barcobalen)11, nonché l’integrazione genomica di semi-maschera-trasponesi dei geni della fluoroproteina, in precedenza tramite transgenesi somatica (CLoNE)12.

Per quanto riguarda il terzo numero, l’esito morfometrico è spesso influenzato da una grande variabilità casuale, originata da differenze tra animali e contingenze di iniezione cellulare. Per questo motivo, un gran numero di animali è di solito impiegato per ottenere il potere statistico necessario per valutare l’attività morfometrica GOI.

Gli approcci descritti in precedenza spesso si basano su competenze tecniche avanzate e richiedono risorse finanziarie cospicue, che possono limitare la loro diffusione all’interno della comunità scientifica. Per aggirare questi problemi, abbiamo concepito una pipeline semplice e diretta per sezionare il controllo genetico della neuroarchitettura in vivo in modo rapido e conveniente. Questo è ispirato da un design di co-trapianto simile precedentemente sviluppato per la valutazione veloce in vivo dell’attività transgenica antiblastica13.

In particolare, si pensa che il co-trapianto di precursori neurali “verdi” ingegnerizzati in vitro (“test” e cellule “controllo”) in un cervello neoatale ricevente “nero” possa risolvere contemporaneamente le tre questioni chiave sopra elencate. Infatti, in vitro lentivirale dei precursori, in condizioni ben controllate, consente il mantenimento della variabilità dell’espressione transgenica neuronale al minimo, molto al di sotto di quella solitamente associata a manipolazioni somatiche in vivo (eseguite in precedenza 14 Del sistema , 15 e nei nostri risultati inediti). Il controllo accurato risultante dell’espressione genica è paragonabile a quello ottenuto da modelli transgenici controllati da tet. Tuttavia, i costi di questa procedura sono di gran lunga inferiori a quelli derivanti dal mantenimento di una linea murina transgenica. Successivamente, l’iniezione di celle a mano libera è facile e richiede un addestramento minimo. Inoltre, la quantità di precursori etichettati iniettati in ogni cervello può essere facilmente messa a punto per ottenere un numero cumulativo sufficiente di precursori scarsamente distribuiti, mantenendo al contempo il numero totale di animali trapiantati. Infine, ma non meno importante, la coiniezione di diversi precursori con etichettatura fluoro, “test” e “controllo” e la successiva analisi statistica a coppie dei risultati contrastano gli effetti della variabilità sperimentale interanimale, consentendo il raggiungimento di significato statistico dei risultati, anche dopo l’analisi di un numero limitato di individui13.

Va sottolineato che, anche se veloce ed economico, questo metodo ha due limitazioni principali. In primo luogo, è progettato per studiare il controllo genico autonomo delle cellule dell’architettura neuronale e non è appropriato affrontare il controllo ambientale. In secondo luogo, poiché i precursori neuronali trapiantati raggiungono la loro posizione finale da un programma eterocronico, questo metodo è preferibile al controllo neuroarchitettonico modello che si verificano oltre il completamento della migrazione.

Protocol

Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dal SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC). 1. Generazione di piscine progenitori “verdi” ingegnerizzate Preparazione della piscina “verde” Accoppiare una femmina di tipo selvaggio CD1 con un Fondatore di MtaptEGFP / s 16 . Eutanasia la diga incinta per lussazione cervicale a 12,5 giorni dopo il coitum (giorno 0 è determinato d…

Representative Results

Esistono cinque set di dati primari che forniscono informazioni utili sugli aspetti chiave della procedura, il primo è (1) l’efficienza della trasduzione e co-trasduzione dei precursori neurali da parte dei vettori lentivirali. (2) Un esempio di caratteristiche chiave dei promotori impiegati per guidare il “gene di prova”. (3) Un esempio di cellule ingegnerizzate pronte per il trapianto. (4) Una vignetta che include i dettagli procedurali chiave della microiniezione cellulare nel cervell…

Discussion

Aspetti/passaggi specifici di questa procedura sono fondamentali e richiedono particolare attenzione. In primo luogo, (a) gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per manipolare in modo sicuro i lentivirus in un ambiente di laboratorio conforme a BSL-2. In secondo luogo, (b) prima di mescolare “test” e “controllo” preparati neurali, è obbligatorio lavare attentamente le due sospensioni neurosfera corrispondenti come descritto, al fine di prevenire qualsiasi infezione incrociata ritardata dei due preparati a …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Mihn Duc Do per il suo contributo alla creazione anticipata di questa procedura.

Materials

0.3 mL syringe BD 320840 store at RT
0.45 μm sterile filter Millex-HV SLHU033RS store at RT
12 multiwell plate Falcon 353043 store at RT
1X PBS Gibco 14190-094 store at RT
24 multiwell plate Falcon 351147 store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 Tebubio GTX13970 store at -20 ℃
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 Antibodies Online ABIN334653 store at +4 ℃
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 Covance MMS-435P store at -20 ℃
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA store at RT
Blue light lamp Nightsea BLS2 store at RT
Borosilicate capillaries Kwik-Fil TW150-4 store at RT
BSA Sigma A9647 store at +4 ℃
Bürker chamber Sigma BR719520 0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik) Bio-Optica 05-9801 store at RT
DAPI Sigma D9542 store at +4 ℃
Disposable embedding mold Bio-Optica 07MP7070 DispoMold07
DMEM/F-12 Gibco 31331-028 store at +4 ℃
Dnase I Roche 10104159001 store at +4 ℃
Doxycicline Sigma D1822 store at +4 ℃
Dumont forceps #3c Fine Science Tools 11231-20 store at RT
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-20 store at RT
EGF Gibco PHG0311 store at -20 ℃
EGTA Sigma E3889 store at RT
FGF Gibco PHG0261 store at -20 ℃
Fine scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09 store at RT
Fungizone (Amphotericin B) Gibco 15290018 store at -20 ℃
Glucose Sigma G8270 store at RT
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488 Invitrogen A11039 store at -20 ℃
Goat anti-rat Alexa 594 Invitrogen A11007 store at -20 ℃
Heparin Solution Stem Cell Technologies 07980 store at +4 ℃
N2 Supplement Gibco 17502048 store at -20 ℃
Optical fibers Leica CLS150X store at RT
P1000 puller Sutter Instruments P-1000 model Flaming/Brown Micropipette Puller
Parafilm Bemis PM-996 store at RT
Pen Strep Sigma P0781 store at -20 ℃
Petri dish Falcon 353003 store at RT
PFA Sigma 158127 store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] built in house
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] built in house
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] built in house
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] built in house
Plasmid #484 [LV_lacZ] Addgene 12108
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] built in house
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] built in house
Scalpel Braun BB515 store at RT
Steromicroscope Leica MZ6 store at RT
Trypan blue Gibco 15250-061 store at RT
Trypsin Gibco 15400-054 store at -20 ℃
Trypsin inhibitor Sigma T6522 store at +4 ℃

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Chiola, S., Santo, M., Mallamaci, A. Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies. J. Vis. Exp. (147), e59242, doi:10.3791/59242 (2019).

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