Summary

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

Published: September 12, 2019
doi:

Summary

Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello murino clinicamente rilevante del cancro al fegato che riassume le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC).

Abstract

L’assenza di un modello animale clinicamente rilevante che affronti le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC) ha ostacolato significativamente la chiarimento dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative. Per sviluppare un modello animale ideale che riassume l’HCC umano, i topi maschi immunocompetenti C57BL/6J ricevono prima un’iniezione di tetracloruro di carbonio (CCl4)per indurre la fibrosi epatica, quindi ricevono epatociti oncogenici istogenici-normali dal giovane maschio L’antigene SV40 T (TAg)-mice transgenico (MTD2) per inoculazione intrasplenica (ISPL). Androgeno generato in topi maschi destinataria alla pubertà avvia l’espressione TAg sotto il controllo di un promotore specifico del fegato. Di conseguenza, gli epatociti trasferiti diventano cellule tumorali e formano masse tumorali nell’impostazione della fibrosi epatica/cirrosi. Questo nuovo modello imita l’inizio e la progressione umana dell’HCC nel contesto della fibrosi/cirrosi epatica e riflette le caratteristiche più tipiche dell’HCC umano, inclusa la disfunzione immunitaria.

Introduction

Il cancro epatocellulare (HCC) è il tipo di cancro in più rapido aumento negli Stati Uniti (USA)1,2,3. Ogni anno, circa 850.000 nuovi casi vengono diagnosticati4,5 e 700.000 pazienti muoiono per questa malattia letale6,7,8,9,10 , rendendola la seconda causa più alta di morte legata al cancro al mondo. La gestione dell’HCC comprende resezione chirurgica, trapianto, ablazione, chemioembolizzazione, o terapie sistemiche, come sorafenib11. La diagnosi precoce e la gestione con resezione chirurgica o trapianto hanno il più alto beneficio di sopravvivenza complessiva4. Purtroppo, la maggior parte dei pazienti presentano in una fase successiva e richiedono la gestione con ablazione, chemioembolizzazione o sorafenib12. Sorafenib, un inibitore della chinasi recettore (RTKI), è stato approvato dalla Food and Drug Administration nel 2008 come l’unica terapia farmacologica sistemica disponibile per il trattamento di HCC non aggiornabile. Anche se il farmaco fornisce solo un modesto aumento della sopravvivenza complessiva, da 7,9 a 10,7 mesi13, ha fornito una nuova strategia terapeutica che potrebbe essere utilizzata per gestire l’HCC.

La manipolazione del sistema immunitario per eliminare i tumori stabiliti è un settore in rapida crescita nella ricerca sul cancro14. Gli studi sui checkpoint immunitari hanno notevolmente avanzato lo sviluppo di farmaci immunoterapeutici nel trattamento del cancro15,16. La FDA ha approvato l’uso di anticorpi (Abs) contro l’antigene citotossico T-linfocito 4 (CTLA-4), la proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1), e la sua PD-L1 legante per il trattamento del melanoma, del cancro ai polmoni, al cancro della testa e del collo e cancro alla vescica17, 18 mi lato , 19 del 12 , 20.Le sperimentazioni cliniche di monoterapia o terapia combinata utilizzando uno o più anticorpi contro PD-1, PD-L1 o CTLA-4 per il trattamento di HCC avanzato sono in corso21,22,23e alcuni hanno mostrato risultati favorevoli. Nel 2017, la FDA ha concesso l’approvazione accelerata per gli anticorpi anti-PD-1 per il trattamento dei pazienti HCC, che sono resistenza allo sorafenib, ma il tasso di risposta complessivo di questa terapia è solo del 14,3%. Altre strategie non sono state tradotte in pratica clinica in questo momento24,25. Superare la tolleranza immunitaria profonda indotta dal tumore per migliorare la terapia del checkpoint immunitario26; prevedere l’efficacia della terapia con checkpoint immunitario; prevenire eventi avversi legati al sistema immunitario; ottimizzazione del percorso amministrativo, del dosaggio e della frequenza; e trovare combinazioni efficaci di terapie27,28,29 tutti rimangono compiti estremamente impegnativi.

Ci sono diversi approcci convenzionali utilizzati per indurre HCC nei modelli murini attualmente e sono utilizzati a seconda della particolare domanda di ricerca dello sperimentatore30. I modelli murini HCC indotti chimicamente con composti genotossici imitano la malignità indotta da lesioni. I modelli di Xenotrapianto attraverso l’impianto ectopico o ortotopico delle linee cellulari HCC sono adatti per lo screening farmacologico. Un certo numero di topi geneticamente modificati sono stati progettati per studiare la fisiofisiologia dell’HCC. I topi transgenici che esprimono geni virali, oncogeni e/o fattori di crescita consentono l’identificazione delle vie coinvolte nell’epatocarcinogenesi. A causa di limitazioni intrinseche, questi modelli non riassumono le caratteristiche immunitarie tipiche osservate nell’HCC umano, il che ha ostacolato significativamente la chiarificazione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative14 ,15. Recentemente abbiamo creato un modello murino clinicamente rilevante. Questo nuovo modello non solo imita l’inizio e la progressione umana dell’HCC, ma riflette anche le caratteristiche più tipiche della malattia umana, inclusa la disfunzione immunitaria. Abbiamo caratterizzato le sue caratteristiche biologiche e immunologiche. Sfruttando questo nuovo modello, abbiamo esplorato varie strategie immunoterapeutiche per trattare HCC31,32,33,34,35,36, 37. Questa piattaforma unica ci permette di studiare i meccanismi dell’immunotolleranza indotta dal tumore e di sviluppare strategie terapeutiche proof-of-concept per l’HCC verso un’eventuale traduzione clinica.

Protocol

NOTA: Tutta la procedura, inclusi i soggetti animali, è stata approvata dall’IACUC presso l’Università del Missouri. Tutti i topi hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati nella “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio”. La seguente procedura per l’isolamento cellulare e l’inoculazione deve essere eseguita in un cofano. Tutti gli esecutori devono indossare l’attrezzatura protettiva personale standard per la manipolazione dei topi e dei tessuti. 1. Induzione di fibros…

Representative Results

Gli epatociti oncogeni isolati dai topi transgenici TAg (Figura 2) sono stati seminati nel fegato di topi selvatici mediante iniezione intrasplenica (Figura 3). Gli epatociti trapiantati con successo e in modo affidabile sono cresciuti con successo e in modo affidabile tumori HCC ortotopici (Figura 4) con antigene tumorale specifico SV40 TAg (Figura 5) nell’impostazione di infiammazione epatica e fibrosi ( Figura1). <p class="jove_co…

Discussion

Con questo protocollo, abbiamo stabilito un modello murino affidabile e riproducibile di HCC che imita l’inizio e la progressione umana dell’HCC. Clinicamente, molti fattori di rischio successivamente inducono lesioni epatiche, fibrosi epatica, cirrosi e la fase finale di HCC. Nel nostro protocollo, l’iniezione IP di CCl4 viene utilizzata per produrre prima fibrosi epatica in topi selvatici, che consente ai successivi epatociti oncogeni di formare i tumori nell’impostazione della fibrosi epatica. Abbiamo scope…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O’Carroll, PI) e NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O’Carroll).

Materials

Anesthesia machine VETEQUIP IMPAC6 anesthesia machine for surgery
Butterfly needle BD 8122963 Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice Jackson Lab 000664  mice used in prototol
Carprofen CRESCENT CHEMICAL 20402 carprofen for pain release
Cell Strainer  CORNING REF 431751 Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge for cell isolation
Clips  Teleflex Medical REF 523700 Titanium Clips for spleen
Microscope Zeiss Primovert  microscope for cell observation
Mtd2 mice N/A Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle BD REF 305109 BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture ETHICON J303H coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody Abcam ab16879 anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe BD REF 309626 1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue SIGMA T 8154 Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips Reflex reflex9, Part. No. 201-1000 stainless steel wound clips for wound close

Riferimenti

  1. O’Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma – United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
  2. Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
  3. Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O’Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
  4. Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. Hepatocellular Carcinoma. Nature reviews. Disease primers. 2, 16018 (2016).
  5. Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
  6. Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
  7. Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362, 1907-1917 (2003).
  8. Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
  9. Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
  10. Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
  11. Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
  12. Pang, T., Lam, V. Surgical management of hepatocellular carcinoma. World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).
  13. Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
  14. Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
  15. Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
  16. Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
  17. Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
  18. Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
  19. Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
  20. Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
  21. Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
  22. Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
  23. Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
  24. Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
  25. Liu, D., Staveley-O’Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
  26. Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
  27. Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
  28. Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
  29. Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
  30. Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  31. Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
  32. Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
  33. Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
  34. Staveley-O’Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
  35. Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
  36. Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
  37. Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
  38. Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
  39. Hanahan, D., Weinber, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Qi, X., Schepers, E., Avella, D., Kimchi, E. T., Kaifi, J. T., Staveley-O’Carroll, K. F., Li, G. An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e59368, doi:10.3791/59368 (2019).

View Video