Summary

Lipidomica e trascrittomica nelle malattie neurologiche

Published: March 18, 2022
doi:

Summary

Questo articolo presenta un protocollo modulare per la lipidomica e la trascrittomica tissutale e la lipidomica plasmatica in modelli murini di malattie neurologiche che mirano ai lipidi sottostanti l’infiammazione e l’attività neuronale, i lipidi di membrana, i messaggeri a valle e gli enzimi / recettori che codificano per l’mRNA alla base della funzione lipidica. Vengono delineate le procedure di campionamento, elaborazione dei campioni, estrazione e quantificazione.

Abstract

I lipidi fungono da interfaccia primaria per insulti cerebrali o stimoli favorevoli alle malattie neurologiche e sono un serbatoio per la sintesi dei lipidi con varie funzioni di segnalazione o ligando che possono sottolineare l’insorgenza e la progressione delle malattie. Spesso cambiando a livello presintomatico, i lipidi sono una fonte emergente di bersagli farmacologici e biomarcatori. Molte malattie neurologiche presentano neuroinfiammazione, neurodegenerazione ed eccitabilità neuronale come segni distintivi comuni, in parte modulati da specifici sistemi di segnalazione lipidica. L’interdipendenza e l’interrelazione della sintesi di vari lipidi richiede un’analisi multilipidica, multienzimatica e multirecettore al fine di ricavare i punti in comune e le specificità dei contesti neurologici e di accelerare il dipanarsi degli aspetti meccanicistici dell’insorgenza e della progressione della malattia. L’attribuzione di ruoli lipidici a regioni cerebrali distinte fa progredire la determinazione del fenotipo molecolare lipidico e della morfologia associata a una malattia neurologica.

Qui viene presentato un protocollo modulare adatto per l’analisi dei lipidi di membrana e dei segnali lipidici a valle insieme all’mRNA di enzimi e mediatori alla base della loro funzionalità, estratti da regioni cerebrali discrete che sono rilevanti per una particolare malattia e / o condizione neurologica. Per garantire un’accurata profilazione lipidomica comparativa, i flussi di lavoro e i criteri operativi sono stati ottimizzati e standardizzati per: i) campionamento cerebrale e dissezione delle regioni di interesse, ii) co-estrazione di più segnali lipidici e lipidi di membrana, iii) doppia estrazione lipidico/mRNA, iv) quantificazione mediante cromatografia liquida monitoraggio a reazioni multiple (LC/MRM) e v) profilazione standard dell’mRNA. Questo flusso di lavoro è suscettibile per le basse quantità di tessuto ottenute dal campionamento delle sottoregioni cerebrali funzionalmente discrete (cioè mediante punzonatura cerebrale), prevenendo così pregiudizi nell’analisi multimolecolare dovuti all’eterogeneità tissutale e / o alla variabilità animale. Per rivelare le conseguenze periferiche delle malattie neurologiche e stabilire letture molecolari traslazionali degli stati di malattia neurologica, il campionamento degli organi periferici, l’elaborazione e la loro successiva analisi lipidomica, nonché la lipidomica plasmatica, sono anche perseguiti e descritti. Il protocollo è dimostrato su un modello murino di epilessia acuta.

Introduction

I recenti progressi nella funzione dei lipidi e il loro ruolo nell’insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche aprono nuove sedi di ricerca e sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e delucidazione del meccanismo della malattia1. Le differenze documentate nella composizione lipidica in diverse regioni del cervello, enfatizzate dalle moderne tecniche di imaging molecolare come l’imaging con spettrometria di massa e la profilazione avanzata della spettrometria di massa, spostano il paradigma dell’indagine lipidica dall’intero cervello verso regioni cerebrali funzionalmente distinte e discrete. Il fatto che la composizione lipidica vari nelle diverse regioni del cervello induce a una nuova concettualizzazione sia della sensibilità lipidica di membrana che della segnalazione lipidica a valle in risposta a un insulto o stimoli cerebrali attraverso le regioni cerebrali funzionalmente distinte. Pertanto, i protocolli lipidici richiedono nuovi sviluppi per affrontare la sfida di basse quantità di tessuto per il rilevamento e la quantificazione di una risoluzione spaziale più elevata e, contemporaneamente, l’analisi di più componenti lipidici delle membrane cellulari e delle vie di segnalazione. Inoltre, la determinazione di enzimi, ligandi lipidici e recettori coinvolti nella regolazione dei loro livelli e della loro funzione è fondamentale per chiarire le vie di segnalazione colpite in una malattia neurologica e guidare nuove indagini meccanicistiche in un contesto fisiopatologico.

Oltre all’aumento della risoluzione spaziale del cervello, ci sono due grandi difficoltà che sfidano lo sviluppo di nuovi approcci neurolipidomici. In primo luogo, le molecole di segnalazione lipidica sono tipicamente di abbondanza molto bassa rispetto ai lipidi costitutivi di membrana. In secondo luogo, il lipidoma presenta un’elevata eterogeneità strutturale, difficile da sezionare utilizzando un unico approccio analitico. Quindi, i metodi di estrazione e analisi sono adattati a diverse categorie lipidiche e comunemente eseguiti in campioni di tessuto distinti2. Metodi lipidomici shotgun3 sono strumenti eccellenti per rivelare rapidamente un ampio profilo dei lipidi di membrana, mentre l’aumento della sensibilità e della selettività offerte dalla scoperta mirata e dalla quantificazione dei metodi spettrometrici di massa sono capitalizzati per lo studio di lipidi di segnalazione a bassa abbondanza tra cui: i) lipidi infiammatori e ii) lipidi coinvolti nella modulazione dell’attività neuronale, come endocannabinoidi (eCB), lipidi legati agli amminoacidi, and so on.4,5. Per comprendere i cambiamenti lipidici sia a livello di membrana cellulare che di segnalazione che si verificano nelle regioni cerebrali dei modelli di malattie neurologiche, in genere l’estrazione e l’analisi dei lipidi vengono eseguite in campioni di tessuto distinti, ottenuti da lotti animali distinti o da emisferi diversi, o sezionando una regione tissutale più ampia in più pezzi. Quando anche i livelli di mRNA dei recettori enzimatici sono di interesse, la loro indagine richiede in genere l’approvvigionamento di un campione di tessuto distinto. Ad esempio, lo studio dei lipidi di membrana, dei cannabinoidi endogeni e dell’mRNA richiederebbe tre diversi campioni di tessuto (ad esempio, due campioni per i due metodi di estrazione dei lipidi – lipidi di membrana e lipidi di segnalazione – e successivi due metodi di analisi dei lipidi – e un campione per l’analisi dell’mRNA). Lo studio dei lipidi infiammatori e dei cannabinoidi endogeni richiede due distinti campioni di tessuto, metodi di estrazione e metodi di analisi, rispettivamente. Un altro esempio è lo studio dell’mRNA e di qualsiasi categoria lipidica in un campione di punch cerebrale o di microdissezione laser che di conseguenza richiede due animali distinti per procurarsi due campioni per (sotto)regione del cervello. In questi casi si verifica frequentemente una notevole variabilità e/o scarsa riproducibilità dei risultati, derivante dalla variabilità biologica e/o dall’eterogeneità tissutale. Guidato da queste limitazioni pratiche dell’analisi multimolecolare, che si verificano in particolare ad alta risoluzione spaziale nel cervello, è stato progettato un protocollo di neurolipidomica a tre moduli che comprende: 1) coestrazione e co-analisi da parte di LC / MRM di lipidi infiammatori (ad esempio, eicosanoidi (eiCs)) e lipidi coinvolti nella modulazione dell’attività neuronale, come gli eCB2; 2) co-estrazione di fosfolipidi (PL) ed eCB con successiva analisi multiscan LC/MRM e precursor/neutral loss scan2; e 3) doppia estrazione di lipidi di membrana (fosfo)lipidi ed eCB nonché di mRNA, con successiva analisi di sequenziamento LC/MRM e qPCR o RNA6. A seconda della questione biologica da affrontare in una malattia neurologica e della regione cerebrale di interesse, una combinazione del primo e del secondo protocollo, o del primo e del terzo protocollo, può essere applicata sullo stesso campione di tessuto per tessuti di peso di circa 4 mg. Il primo e il terzo protocollo possono essere applicati in modo indipendente per i tessuti intorno ai 2 mg. Il secondo protocollo può essere applicato per tessuti di peso minimo di 0,5 mg. Indipendentemente dal modulo di protocollo neurolipidomico selezionato, il campionamento dei tessuti e l’elaborazione pre-analitica, l’isolamento cerebrale e la dissezione della regione, nonché la procedura per sacrificare il modello animale sono standardizzati e identici per tutti e tre i moduli del protocollo. Nella nostra indagine sulle malattie neurologiche, gli organi periferici che sono rilevanti per le conseguenze patologiche della malattia vengono sempre raccolti e analizzati utilizzando questi protocolli modulari. Inoltre, il sangue viene regolarmente campionato per la lipidomica plasmatica per servire come strumento di lettura delle malattie neurologiche in vista di potenziali applicazioni traslazionali. Il protocollo lipidomico modulare qui presentato è molto versatile: scalabile a quantità di tessuto più grandi e facilmente applicabile praticamente a qualsiasi tipo di tessuto e malattia. Per l’applicazione del protocollo modulare (Figura 1) nelle malattie neurologiche, qualsiasi modello standardizzato di roditori di insorgenza e progressione di disturbi neurologici, come lesioni cerebrali traumatiche, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer o epilessia sono suscettibili.

Questi protocolli sono stati ampiamente applicati per studiare i cambiamenti nel lipidoma tissutale e/o nel trascrittoma nella fase acuta dell’epilessia nel modello murino di epilessia indotto dall’acido kainico (KA)2,7, un modello ampiamente utilizzato negli studi preclinici a causa della somiglianza con l’epilessia del lobo temporale umano (TLE)8,9,10,11. Utilizzando questi protocolli, il potenziale terapeutico di farmaci come palmitoiletanolamide (PEA)12,13 è stato valutato nello stesso modello murino di epilessia. Lo studio ha identificato cambiamenti lipidici e mRNA ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e nella periferia, nel punto temporale delle intensità massime di convulsioni acute (a 60 minuti di induzione post-epilettica) e dopo il trattamento subcronico e acuto con PEA in quattro diversi punti temporali (20, 60, 120 e 180 min) dopo l’induzione della crisi ka, una finestra temporale che copre la fase acuta dell’epilessia. Plasma, cervello e organi periferici di topi iniettati con KA non trattati, topi acuti e subcronicamente trattati con PEA, così come topi di controllo veicolo e PEA-veicolo, sono stati raccolti in ogni punto temporale12,13 e studiati con questa analisi molecolare. I dati molecolari sono stati correlati con fenotipi comportamentali ottenuti dal seizure scoring, nonché con dati derivati dall’immunoistochimica sui processi neurodegenerativi, al fine di svelare la progressione della fase di epilessia acuta e il potenziale della PEA per alleviarla.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono conformi alla direttiva del Consiglio della Comunità europea del 22 settembre 2010 (2010/63UE) e sono state approvate dal comitato locale per gli animali dello stato Renania-Palatinato, Germania (riferimento file: 23 177-07/G16-1-075). 1. Modello animale di epilessia acuta e profilatticamente trattata con KA Eseguire l’induzione delle convulsioni, il trattamento e il punteggio comportamentale. Separare i topi (minimo n = 6 t…

Representative Results

L’insieme dei protocolli descritti può essere combinato su diversi livelli in modo specifico per scopo, come la scelta del modello animale, la via di campionamento, il metodo di estrazione e la profilazione (Figura 1). Al fine di determinare i cambiamenti del livello lipidico nel cervello e nella periferia nel corso di un decorso acuto di crisi epilettica e per svelare il potenziale effetto antiepi…

Discussion

La metodologia neurolipidomica e trascrittomica qui descritta è un mezzo praticabile per studiare qualsiasi malattia o sviluppo sano ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e negli organi periferici. Grazie alle procedure ottimizzate di campionamento e manipolazione del plasma, l’analisi lipidomica plasmatica può essere effettuata anche dagli stessi animali sacrificati per la lipidomica e la trascrittomica tissutale, migliorando così l’affidabilità dei correlati molecolari del sangue tissutale e la scoperta…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dedichiamo questo articolo alla Dott.ssa Ermelinda Lomazzo. Durante la finalizzazione di questo manoscritto, la dottoressa Ermelinda Lomazzo è deceduta. È l’incarnazione della passione per la scienza e dell’impegno disinteressato nel lavoro di squadra per soddisfare uno scopo di ricerca significativo. Ha sempre sognato di contribuire in modo significativo al maggiore benessere degli esseri umani. La sua natura di buon cuore non è mai stata compromessa dalle faticose strade della scienza e della vita. Rimarrà inestimabile, e per sempre, nei nostri cuori.

Julia M. Post è stata finanziata dal Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) presso l’University Medical Center dell’Università Johannes Gutenberg di Magonza ed è attualmente finanziata dal progetto SPP-2225 EXIT a LB. Raissa Lerner è stata parzialmente finanziata dal progetto DZHK 81X2600250 a LB e Lipidomics Core Facility. Il finanziamento parziale per questi studi è stato fornito dalla Lipidomics Core Facility, dall’Institute of Physiological Chemistry e dai fondi intramurali (a LB) del Centro medico universitario dell’Università Johannes Gutenberg di Magonza.

Materials

12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

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