Summary

Preparazione di nanoparticelle polimeriche neutralmente cariche e sensibili al pH per la consegna del siRNA citosolico

Published: May 02, 2019
doi:

Summary

Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.

Abstract

Il successo di siRNA come medicina molecolare mirata dipende dalla sua efficace somministrazione citosolica alle cellule all’interno del tessuto della patologia. È stato raggiunto il successo clinico per il trattamento degli obiettivi di malattia epatica precedentemente “non ondulabili” con siRNA. Tuttavia, efficace somministrazione di siRNA tumorale richiede ulteriori considerazioni di progettazione farmacocinetica, tra cui lungo tempo di circolazione, l’evasione degli organi di clearance (ad esempio, fegato e reni), e la penetrazione del tumore e ritenzione. Qui descriviamo la preparazione e la caratterizzazione fisico-chimica/biologica in vitro di nanoparticelle polimeriche progettate per una consegna efficiente del siRNA, in particolare per i tessuti non epatici come i tumori. Le nanoparticelle di siRNA sono preparate con la complessazione elettrostatica di siRNA e il diblock Copolimero Poly (etilene glicole-b-[2-(dimethylamino) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB) per formare complessi poliionici ( polyplexes) dove siRNA è sequestrato all’interno del nucleo Polyplex e PEG forma una corona idrofila, neutralmente caricata. Inoltre, il blocco DB diventa membrana-Lisica come vescicole della via endolysosomiale acidificante (< pH 6,8), innescando la fuga endosomiale e la somministrazione citosolica di siRNA. Sono descritti i metodi per caratterizzare le caratteristiche fisico-chimiche delle nanoparticelle di siRNA, come la dimensione, la carica superficiale, la morfologia delle particelle e il caricamento del siRNA. La bioattività delle nanoparticelle di siRNA viene misurata utilizzando la luciferasi come gene modello in un saggio di silenziamento genico rapido e ad alto rendimento. I disegni che superano questi test iniziali (come i poliplexi basati su PEG-DB) sono considerati appropriati per la traduzione in studi preclinici sugli animali che valutano la somministrazione di siRNA a tumori o altri siti di patologia.

Introduction

Poiché i siRNA inibiscono la traduzione delle proteine dalle sequenze di mRNA, possono teoricamente essere usati per la droga tutte le patologie conosciute1,2,3,4,5. Tuttavia, l’uso di siRNA in medicina è limitato dal profilo farmacocinetico globalmente scarso delle molecole di siRNA6,7. Quando iniettato per via endovenosa, i siRNA vengono rapidamente cancellati attraverso i reni e/o degradati dalle nucleasi8,9. A causa delle sue grandi dimensioni e della carica negativa, siRNA non può entrare nelle cellule o sfuggire alla via endolysosomiale per accedere al complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC) che risiede nel citosol10,11,12, 13. la Così, ampio sforzo si è concentrato sulla progettazione e l’attuazione delle strategie di consegna siRNA14. Questo sforzo si è concentrato principalmente sullo sviluppo di nanoparticelle a base lipidica e polimerica che confezionano siRNA, la proteggono dalla clearance e dalla degradazione in vivo, e avviano l’assorbimento cellulare e la fuga endosomiale attraverso gruppi ionizzabili di ammina cationica. Molti successi pre-clinici sono stati segnalati e, più recentemente, è stato riportato il primo successo clinico per la somministrazione di siRNA epatica basata su nanoparticelle per il trattamento dell’amiloidosi ereditaria da transthyretina (hATTR)15.

Ci sono molti geni che causano il cancro che sono attualmente “ondulabili” dalla farmacologia convenzionale (cioè farmaci di piccole molecole), motivando la progettazione di nanoparticelle polimerica siRNA (si-NPs) per il trattamento del cancro16. Tuttavia, ci sono un insieme separato di parametri di progettazione che devono essere considerati per la consegna non epatica siRNA. Il sistema di erogazione deve proteggere la carica cationica del Polyplex che provoca l’agglutinazione all’interno della circolazione sistemica17,18,19. Per la somministrazione del tumore, in particolare, la stabilità si-NP è essenziale per dotare la lunga circolazione e quindi un aumento dell’accumulo all’interno dei tumori tramite l’effetto di permeabilità e ritenzione potenziata (EPR)20,21. Inoltre, il controllo sulle dimensioni si-NP è essenziale poiché solo le nanoparticelle di circa 20 – 200 Nm di diametro in dimensioni sfruttano EPR22, e più piccoli si-NPS (~ 20 – 50 Nm di diametro) mostrano una migliore penetrazione del tumore su nanoparticelle di dimensioni maggiori e microparticelle23.

Per ovviare a questi vincoli di progettazione aggiuntivi per la somministrazione di tumore sistemico di siRNA dopo somministrazioni endovenose, sono stati sviluppati (Figura 1)24il pH-NPS reattivo. Questi si-NP sono pegilati, o più recentemente, Zwitterionated25, per la carica superficiale neutrale e la resistenza all’adsorbimento proteico e opsonizzazione in circolazione. Poiché non possono affidarsi esclusivamente al carattere cationico per guidare la consegna intracellulare, la fuga endosomiale estremamente efficiente è indispensabile per ottenere un potente silenziamento genico. Di conseguenza, il nucleo di questi si-NPs è composto da un nucleo altamente endosomolitico che è inerte a pH extracellulare (7,4), ma che viene innescato in modo simile a un interruttore nelle condizioni acidificate della via endolysosomiale [pH 6,8 (primi endosomi) – 5,0 ( lisosomi)]. Infine, una miscela di contenuto cationico e idrofobico all’interno del nucleo di si-NPs fornisce sia le forze di stabilizzazione elettrostatiche e Van der Waals, migliorando la stabilità del si-NP nel sangue rispetto ai sistemi semplicemente cationici.

L’integrazione di molte funzioni in un design relativamente semplice è possibile utilizzando la polimerizzazione controllata di trasferimento della catena di addizione reversibile (RAFT) per produrre polimeri con un’architettura complessa e una composizione precisa. Per produrre si-NPs con carica superficiale neutra, pH-reattività, e stabilità NP, zattera è usato per sintetizzare poli (etilene glicole-b-[2-(dimetilammonio) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). PEG-DB è elettrostaticamente complessato con siRNA, formando si-NPs con una corona PEG e DB/siRNA nucleo (Figura 1B). PEG forma uno strato idrofilo inerte e neutralmente caricato sulla corona si-NP. Il blocco DB è costituito da un rapporto molare 50:50 di 2-(dimethylamino) etil metacrilato (DMAEMA) e butile metacrilato (BMA). Cationic DMAEMA elettrostaticamente complessi siRNA caricato negativamente. BMA self-Associates all’interno del nucleo NP da Van der Waals interazioni, aumentando la stabilità NP. Insieme, DMAEMA e BMA impartiscono il comportamento lipidico-lisico del pH-dipendente al blocco polimerico DB. A pH extracellulare, il blocco DB viene sequestrato al nucleo si-NP ed è inerte ai bilayer lipidici. In condizioni acide, come quelle all’interno della via endolysosomiale, la DMAEMA ionizzabile all’interno del blocco DB facilita l’effetto della spugna protonica, dove il buffering endosomiale conduce al gonfiore osmotico e alla rottura26. Inoltre, le frazioni di BMA idrofobica all’interno del blocco DB si integrano attivamente e Lisano i bilayer lipidici, con conseguente potente endosomolisi. Pertanto, siRNA è complessato con PEG-DB per formare si-NPs che sono neutralmente caricati e altamente stabili a pH extracellulare ma che interrompono i bilayer lipidici a pH acido, assicurando la consegna citosolica del payload siRNA.

Qui sono descritte le procedure sperimentali per produrre si-NPs da PEG-DB. I metodi per caratterizzare i parametri fisico-chimici e la bioattività di si-NPs sono presentati e discussi. Al fine di valutare rapidamente la bioattività si-NP, la luciferasi viene utilizzata come gene modello per gli studi di knockdown. Firefly luciferase è la proteina responsabile del ‘ bagliore ‘ delle lucciole27. Di conseguenza, le cellule di mammiferi trasfusate con il gene lucciola luciferasi producono un “bagliore” bioluminescente che può essere catturato utilizzando un luminometro per quantificare i livelli di espressione di luciferasi. Qui, usiamo luciferase per valutare la bioattività di si-NP fornendo siRNA contro luciferase e quantificando la corrispondente riduzione della bioluminescenza nelle cellule che esprimono luciferasi rispetto alle cellule che ricevono un siRNA criptato.

Protocol

1. preparazione e caratterizzazione di si-NPs preparazione si-NP Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.Nota: il polimero può essere disciolto a concentrazioni inferiori, ma l’uso a concentrazioni superiori a 3,33 mg/mL può impedire la formazione di NP omogenee. Aggiungere siRNA (50 μM in diH2O) per determinare N+<…

Representative Results

Alcune caratteristiche essenziali di efficace si-NPs per la consegna in vivo siRNA sono la dimensione corretta (~ 20 – 200 Nm di diametro), siRNA imballaggio, e la bioattività di silenziamento genico. Anche se questo non è un elenco esaustivo (come affrontato nella discussione), queste caratteristiche di base devono essere confermate prima di considerare ulteriori test di una formulazione. La Figura 2</s…

Discussion

I si-NPs qui descritti sono formati da un’associazione elettrostatica di siRNA anionica e polimeri cationici in complessi poliioni (polyplexes). La complessazione elettrostatica di siRNA e il blocco DB cationico dei polimeri PEG-DB sono facilitati dalla miscelazione a basso pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA è altamente protonated, e di conseguenza il blocco DB è altamente carico. Questo assicura che i polimeri si dissolvano come unimers in soluzione al contrario di formare micelle e che i complessi DB in modo efficiente con s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati a DRS. Craig Duvall e Rebecca Cook per l’accesso a dati e risorse di laboratorio per lo svolgimento di questa ricerca. Gli autori sono grati al Vanderbilt Institute for nanoscala Science and Engineering (VINSE) per l’accesso agli strumenti DLS e TEM (NSF EPS 1004083). Gli autori sono grati alla National Science Foundation per aver sostenuto il programma di borse di ricerca graduate (NSF # 1445197). Gli autori sono grati agli istituti nazionali di sanità per il sostegno finanziario (NIH R01 EB019409). Gli autori sono grati al dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca medica per il sostegno finanziario (DOD CDMRP OR130302).

Materials

0.45 mm pore-size syringe filters Thermo Fisher Scientific F25133 17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips Millipore Sigma P4786
10x TAE buffer Thermo Fisher Scientific/Invitrogen AM9869
6-7.7 pH test strips Millipore Sigma P3536
96-well black walled plates Corning 3603 Tissue-culture treated
Agarose Powder Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 16500
Citric acid monohydrate Millipore Sigma C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate Millipore Sigma 71643
D-luciferin Thermo Fisher Scientific 88294 Monopotassium Salt
DMEM Gibco 11995065 High glucose and pyruvate
Ethanol Millipore Sigma 459836
ethidium bromide Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 15585011
FBS Gibco 26140079
loading dye Thermo Fisher Scientific/Invitrogen R0611
Luciferase siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells GenTarget Inc SC059-Bsd Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate Millipore Sigma S9638
Scarmbled siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes Fisher Scientific 14-955-129 4.5 mL capacity
TEM grids Ted Pella, Inc. 1GC50 PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804
uranyl acetate Polysciences, Inc. 21447-25

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Citazione di questo articolo
Hendershot, J., Smith, A. E., Werfel, T. A. Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery. J. Vis. Exp. (147), e59549, doi:10.3791/59549 (2019).

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