Abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare e purificare i periciti cardiaci murini per la ricerca di base e lo studio del loro potenziale di biologia e terapia.
Periciti, cellule perivascolari di microvessels e capillari, sono noti per svolgere un ruolo nell’angiogenesi, stabilizzazione del vaso, e l’integrità della barriera endoteliale. Tuttavia, le loro funzioni specifiche del tessuto nel cuore non sono ben comprese. Inoltre, attualmente non esiste un protocollo che utilizzi materiali facilmente accessibili per isolare e purificare i periciti di origine cardiaca. Il nostro protocollo si concentra sull’utilizzo del modello di mammifero ampiamente utilizzato, il mouse, come fonte di cellule. Utilizzando la digestione enzimatica e la dissociazione meccanica del tessuto cardiaco, abbiamo ottenuto una miscela di cellule grezze che è stata ulteriormente purificata dalla fluorescenza attivando lo smistamento cellulare (FACS) da una pletora di marcatori. Poiché non esiste un singolo marcatore inequivocabile per i periciti, abbiamo annullato le celle che erano CD31–CD34–CD45 – CD45–CD140b,NG2eCD146. Dopo la purificazione, queste cellule primarie sono state coltivate e passaggiate più volte senza alcuna modifica nella morfologia e nell’espressione dei marcatori. Con la capacità di ottenere regolarmente periciti cardiaci murini primari utilizzando il nostro protocollo, speriamo di comprendere ulteriormente il ruolo dei periciti nella fisiologia cardiovascolare e il loro potenziale terapeutico.
Le cellule perivascolari note come periciti circondanoi microvasi e i capillari dell’albero vascolare 1,2. Fisiologicamente, sono noti per promuovere e svolgere un ruolo nell’angiogenesi, aumentare l’integrità della barriera a causa della loro stretta relazione con le cellule endoteliali, nonché stabilizzare e maturi vasi1,2. Inoltre, la disfunzione e/o la perdita di queste cellule sono state implicate in malattie come il morbo di Alzheimer2,3 e varie malattie cardiovascolari4. Queste cellule si trovano in tutto il corpo, ma i numeri delle cellule sono dipendenti dal tessuto. I periciti sono stati studiati in particolare nel cervello a causa dell’elevata vascolarizzazione della barriera emato-encefalica1,2. Tuttavia, nel cuore, la biologia dei periciti è poco studiata.
Recentemente, ci sono maggiori interessi nel campo per i periciti cardiaci, ma attualmente non esiste un protocollo semplificato disponibile per il loro isolamento da uno degli strumenti più utilizzati in biologia: il topo. Ci sono protocolli nella letteratura sull’isolamento dei periciti dal cervello5, retina6, placenta7e muscolo scheletrico8,9; tuttavia, pochi protocolli sono sull’isolamento dei periciti dal cuore. Ci sono diversi gruppi che hanno isolato i periciti cardiaci. Nees e altri sono stati in grado di isolare un’abbondante quantità di periciti cardiaci da più specie tra cui il topo; tuttavia, i loro metodi utilizzavano specifiche attrezzature costruite internamente che riducono la riproducibilità10. Avolio et al.11, Chen et al.12e Baily et al.13 hanno anche isolato con successo i periciti cardiaci isolati dal tessuto cardiaco umano, ma i tessuti umani non sono sempre disponibili e difficili da ottenere per alcuni ricercatori. Qui, abbiamo sviluppato un metodo di isolamento per ottenere periciti cardiaci dai modelli murini per i ricercatori per studiare ulteriormente la loro biologia con materiali prontamente disponibili.
Utilizzando la digestione enzimatica e la fluorescenza activated cell sorting (FACS) con noti marcatori chiave periciti14, il nostro protocollo ci permette di isolare e purificare una popolazione di periciti che sono caratterizzati da CD31–CD34–CD45– CD140b:NG2,CD146,. Il nostro pannello di marcatori contiene sia marcatori di inclusione che di esclusione. CD45 è usato come marcatore per escludere le cellule ematopoietiche. CD31 viene utilizzato come marcatore per escludere le cellule endoteliali. CD34 è usato come marcatore per escludere cellule progenitrici ed ematopoietiche ed endoteliali. CD146 è un marcatore per le cellule perivascolari. Infine, NG2 e CD140b (noto anche come platelet derived growth factor recettor beta – PDGFR) sono entrambi marcatori accettati per i periciti14. La cultura primaria ottenuta può essere coltivata e scolata più volte senza cambiamenti nella morfologia o nell’espressione dei marcatori. Inoltre, queste cellule possono essere co-coltivate con cellule endoteliali per studiare le loro interazioni e incrociare tra loro. Questo metodo di isolamento cellulare permetterà agli sperimentatori di studiare la biologia e la fisiofisiologia dei periciti cardiaci da modelli di topo selvatici, malattie e geneticamente varianti.
Poiché gli studi sui periciti cardiaci sono relativamente nuovi, il ruolo dei periciti nella fisiologia cardiovascolare e nella fisiopatologia deve ancora essere definito. In altri organi, hanno dimostrato di svolgere ruoli chiave nell’omeostasi del vaso e nella perfusione1,2. Rispetto alla letteratura dei periciti di altri organi come il cervello, ci sono significativamente meno pubblicazioni sui periciti cardiaci. L’isolamento dei periciti cardiaci è fondamentale per la comprensione delle loro caratteristiche funzionali e dei meccanismi di segnalazione. Pertanto, questo protocollo fornirà agli sperimentatori un modo più semplice per accedere ai periciti cardiaci da una fonte tissutale più prontamente disponibile e promuovere gli studi sulla loro biologia. Aiuterà a rispondere a domande su come i periciti cardiaci contribuiscono all’omeostasi cardiaca e alla fisiofisiologia, nonché a studiare il loro potenziale terapeutico.
La popolazione pericita isolata dal cuore murino e caratterizzata da CD31–CD34–CD45–CD140b–NG2–CD146– è stata passata più volte (fino a P12 e stava ancora andando forte), il che non diminuzione della redditività e propaga rapidamente (Figurasupplementare 2). Le cellule sono state anche criocongelate e recuperate con almeno il 95% di redditività. Tuttavia, preferiamo usare le cellule P7 o più giovani per i nostri esperimenti. Confrontando le immagini luminose dei nostri periciti con i periciti del cervello umano, le due linee cellulari hanno morfologia cellulare comparabile (Figura 4A) mentre differiscono nella morfologia dalle cellule muscolari lisce (Figura 4A). Le nostre cellule P7 sono state caratterizzate da immunocitochimica per i marcatori di pericito, alcune del nostro pannello FACS (NG2 e CD140b), e alcune non nel pannello (vimentin, desmin, sMA) e abbiamo scoperto che le cellule espresse marcatori periciti omogeneamente (Figura 4B). Inoltre, le nostre cellule P7 sono state analizzate dalla citometria di flusso di nuovo con lo stesso pannello marcatore per valutare le modifiche nell’espressione del marcatore a causa del passaging e abbiamo scoperto che non ci sono state modifiche (Figura 4C). Pertanto, sia fenotipicamente che morfologicamente, le nostre cellule sono periciti.
Gli studi di Nees et al.10, Avolio et al.11, Chen et al.12e Baily et al.13 hanno mostrato immiciti cardiaci periciti di successo. Tuttavia, l’uso di un’apparecchiatura costruita su misura interna per staccare i periciti dalle microvessels di Nees et al.10 prevedeva due camere con pompe che perfusavano soluzione proteasi avanti e indietro attraverso una pila di reti a rete, che era difficile da replicare in quanto non ha fornito uno schema e/o un’immagine dell’apparecchio e di come è stato costruito. Anche se Nees et al.10 hanno isolato con successo periciti cardiaci di molte specie, non siamo mai stati in grado di riprodurre il loro metodo. La nostra fase di distacco pericito nel nostro protocollo utilizza semplicemente uno shaker orbitale (per dissociare tutte le cellule) che è disponibile nella maggior parte, se non in tutti i laboratori, con la soluzione tissutale ed enzimatica in un tubo conico seguito da una fase di dissociazione meccanica. Non è richiesto alcun apparato personalizzato. In secondo luogo, i restanti protocolli prevedono l’uso di tessuti umani e quindi l’approvvigionamento di tessuto umano limita agli investigatori. Il nostro protocollo è unamodifica e ottimizzazione degli attuali protocolli 9,12 utilizzando modelli murini (tipo selvaggio, geneticamente modificato, malato) e materiali che sono prontamente disponibili a tutti gli investigatori.
Poiché le cellule perivascolari in generale sono sensibili, la vitalità delle cellule è fondamentale per ottenere una buona resa. Durante l’approvvigionamento del tessuto cardiaco e la colorazione delle cellule, il tessuto/cellule deve essere mantenuto freddo ghiaccio. In secondo luogo, la digestione enzimatica del tessuto può richiedere l’ottimizzazione su base individuale. A seconda delle unità di attività sulle proprie fiale di enzimi, concentrazione e tempo di digestione potrebbe essere necessario ottimizzare. Assicurarsi che la soluzione ezimatica viene preparata fresco ogni volta altrimenti la resa diminuirà. In terzo luogo, la miscela grezza contiene un sacco di cellule, alcune morti e / o morenti, è meglio abbassare la concentrazione di FBS nel buffer di colorazione dal 5% al 2%. Se hai problemi con le cellule che intasano l’ugello durante l’ordinamento, arricchisci prima le cellule utilizzando un kit di rimozione delle cellule morte. È inoltre possibile aggiungere il buffer EDTA/HEPES o il trattamento DNase al pre-sort e-nicore cellulare per evitare l’agglomerazione delle cellule. Infine, poiché il nostro gruppo di anticorpi è piuttosto grande e utilizza molti fluorofori, assicurati che i controlli FMO e i controlli di compensazione siano eseguiti correttamente.
Una limitazione a questo metodo è la quantità di periciti cardiaci che possono essere ottenuti per cuore. Nel nostro caso, solo l’1,1% della nostra miscela grezza da un cuore di topo erano periciti che è paragonabile alla percentuale negli isolamenti del cuore umano, ma il numero di cellule è significativamente inferiore a causa della quantità di tessuto cardiaco che un topo fornisce. Poiché il numero iniziale di cellule è così basso dopo FACS, sarebbe meglio isolare da più cuori contemporaneamente. Tuttavia, il problema con questo è il gran numero di celle che è necessario ordinare in un giorno. Se hai più di 30 milioni di cellule, sarà difficile superare il tipo senza influire sulla vitalità delle cellule. Se l’investigatore avesse più selezionatrici cellulari, isolarsi da più cuori in un giorno sarebbe fattibile. Un’altra limitazione è che perché non sappiamo se ci sono sottopopolazioni di periciti nel cuore come se ci fosse muscolo scheletrico15,16, non sappiamo se stiamo eliminando un sottotipo nella nostra strategia di gating. Siamo in procinto di caratterizzare i nostri periciti cardiaci e finora nei nostri dati inediti, sono funzionalmente come altri periciti in letteratura.
Il nostro protocollo consentirà agli sperimentatori di rispondere a domande sulle proprietà cardiache dei periciti, le caratteristiche, la funzionalità e altri aspetti che aiuteranno a definire il loro contributo all’omeostasi cardiaca e all’emodinamica. Queste cellule potrebbero avere un potenziale terapeutico per le malattie cardiovascolari una volta che la loro biologia è meglio compresa.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare amgen Flow Cytometry Core per il loro aiuto con la progettazione del pannello fluoroforo, la risoluzione dei problemi e lo smistamento delle celle.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
24-well plate | Corning | CLS3527 | |
25 gauge butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
31 gauge needle syringe | FisherSci | B328446 | |
50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
Brightfield Microscope | camera attached | ||
CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Centrifuge | eppendorf | ||
Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
Confocal Microscope | |||
DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
FACSAria software | BD | ||
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
Fine scissors | FST | 14060-09 | |
FlowJo software | FlowJo LLC | ||
Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
Pipette and tips | |||
ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody – FITC |
Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody – APC |
Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody – BV421 |
Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody – BV605 |
Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody – PE |
Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody – PE-Cy7 |
SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
T75 | ThermoFisher | 156499 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
ViCell Cell counter | Beckman | ||
Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |