I modelli di mutazione somatica nelle cellule riflettono una precedente esposizione mutagena e possono rivelare relazioni di lignaggio dello sviluppo. Qui è presentata una metodologia per catalogare e analizzare le mutazioni somatiche nelle singole cellule staminali ematopoietiche e progenitrici.
Le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) accumulano gradualmente mutazioni del DNA durante una vita, che possono contribuire a malattie associate all’età come la leucemia. Caratterizzare l’accumulo di mutazioni può migliorare la comprensione dell’eziologia delle malattie associate all’età. Presentato qui è un metodo per catalogare le mutazioni somatiche nei singoli HSPC, che si basa sul sequenziamento dell’intero genoma (WGS) delle colture cellulari primarie clonali. Le mutazioni presenti nella cellula originale sono condivise da tutte le cellule della coltura clonale, mentre le mutazioni acquisite in vitro dopo lo smistamento delle cellule sono presenti in un sottoinsieme di cellule. Pertanto, questo metodo consente di rilevare accuratamente le mutazioni somatiche presenti nei genomi dei singoli HSPC, che si accumulano durante la vita. Questi cataloghi di mutazioni somatiche possono fornire preziose informazioni sui processi mutazionali attivi nel tessuto ematopoietico e su come questi processi contribuiscono alla leucemogenesi. Inoltre, valutando le mutazioni somatiche condivise tra più HPC dello stesso individuo, è possibile determinare le relazioni di lignaggio clonale e le dinamiche della popolazione delle popolazioni ematiche. Poiché questo approccio si basa sull’espansione in vitro di singole cellule, il metodo è limitato alle cellule ematopoietiche con un potenziale replicativo sufficiente.
L’esposizione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) a fonti mutagene endogene o estrinseche contribuisce al graduale accumulo di mutazioni nel DNA durante una vita1. L’accumulo graduale di mutazioni negli HSPC1 può provocare l’ematopoiesi clonale legata all’età (ARCH)2,3, che è una condizione non sintomatica guidata da HSPC che trasportano mutazioni leucemia-driver. Inizialmente, si è pensato che gli individui con ARCH hanno un aumentato rischio di leucemia2,3. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato un’incidenza del 95% di ARCH negli individui anziani4, rendendo meno chiara l’associazione con le neoplasie e sollevando la questione del motivo per cui alcuni individui con ARCH alla fine sviluppano neoplasie. Ciò nonostante, le mutazioni somatiche negli HSPC possono comportare gravi rischi per la salute, poiché i disturbi della mielidisticità e la leucemia sono caratterizzati dalla presenza di specifiche mutazioni del driver del cancro.
Per identificare i processi mutazionali e studiare la clonalità del sangue, è necessario caratterizzare l’accumulo di mutazioni nei singoli HSPC. I processi mutazionali lasciano modelli caratteristici nel genoma, le cosiddette firme mutazionali, che possono essere identificate e quantificate in raccolte di mutazioni a livello di genoma5. Ad esempio, l’esposizione alla luce UV, gli agenti alchilanti e i difetti nelle vie di riparazione del DNA sono stati associati a una diversa firma mutazionale6,7. Inoltre, a causa della natura stocastica degli accumuli di mutazione, la maggior parte (se non tutte) delle mutazioni acquisite sono uniche tra le cellule. Se le mutazioni sono condivise tra più cellule dello stesso individuo, indica che queste cellule condividono un antenato comune8. Pertanto, valutando le mutazioni condivise, le relazioni di lignaggio possono essere determinate tra le cellule e un albero di lignaggio dello sviluppo può essere costruito ramo per ramo. Tuttavia, catalogare rare mutazioni somatiche nelle cellule fisiologicamente normali è tecnicamente impegnativo a causa della natura policlonale dei tessuti sani.
Presentato qui è un metodo per identificare e determinare con precisione le mutazioni somatiche nei genomi dei singoli HSPC. Ciò comporta l’isolamento e l’espansione clonale degli HSPC in vitro. Queste colture clonali riflettono la composizione genetica della cellula originale (cioè le mutazioni nella cellula originale saranno condivise da tutte le altre cellule della coltura). Questo approccio ci permette di ottenere DNA sufficiente per il sequenziamento dell’intero genoma (WGS). Abbiamo dimostrato in precedenza che le mutazioni accumulate in vitro durante la coltura clonale saranno condivise da un sottoinsieme di cellule. Ciò consente il filtraggio di tutte le mutazioni in vitro, in quanto queste saranno presenti in una frazione più piccola di letture rispetto alle mutazioni acquisite in vivo9. I metodi precedenti hanno ottenuto DNA sufficiente da una singola cellula per il WGS utilizzando l’amplificazione dell’intero genoma (WGA)10. Tuttavia, lo svantaggio principale di WGA è la sua amplificazione relativamente soggetta a errori e sbilanciata del genoma, che può provocare abbandoni degli alleli11. Ciò nonostante, poiché questo approccio si basa sull’espansione in vitro di singole cellule, è limitato alle cellule del sangue con un potenziale replicativo sufficiente, che non è il caso per i metodi dipendenti da WGA. Gli sforzi precedenti di sequenziamento delle colture clonali si sono affidati all’utilizzo di strati di alimentazione per garantire l’amplificazione clonale di singoli HSPC12. Tuttavia, il DNA proveniente dagli strati dell’alimentatore può potenzialmente contaminare il DNA delle colture clonali, confondendo la successiva chiamata e filtraggio della mutazione. Il metodo qui presentato si basa esclusivamente su un mezzo specificato per espandere clonalmente singoli HSPC, evitando quindi il problema della contaminazione del DNA. Fino ad ora, abbiamo applicato con successo questo metodo sul midollo osseo umano, sul sangue del cordone, sul midollo osseo congelato e sul sangue periferico.
Presentato qui è un metodo per rilevare le mutazioni che si sono accumulate durante la vita nei singoli HSPC e per costruire un albero di lignaggio dello sviluppo precoce utilizzando questi dati di mutazione.
Per eseguire correttamente questi saggi, è necessario soddisfare diversi requisiti critici. In primo luogo, deve essere garantita la fattibilità del campione. La gestione rapida del campione è fondamentale per garantire l’efficienza della procedura. In secondo luogo, la perdita di potenza del fattore di crescita influenzerà negativamente l’espansione clonale degli HSPC. Per garantire un elevato fattore di crescita, è importante evitare cicli di congelamento-scongelamento e preparare aliquote monouso. In terzo luogo, dopo aver eseguito WGS, chiamata di mutazione e filtraggio, è fondamentale convalidare la clonalità della coltura clonale. Per confermare la clonalità della coltura, il VAF delle mutazioni dovrebbe accoppiarsi intorno a 0,5 in un campione cariotipico normale (Figura 3). Nelle cellule con un basso carico mutazionale, come gli HSPC del sangue cordonale, è più difficile determinare la clonalità a causa dei bassi numeri di mutazione.
Il nostro approccio si basa sull’espansione in vitro di singole cellule per consentire il WGS. Pertanto, il nostro approccio è limitato alle cellule che hanno il potenziale replicativo di espandersi clonalmente, ad esempio gli HSPC. Nelle nostre mani, circa il 5%-30% di tutte le cellule singole sono in grado di espandersi adeguatamente. La riduzione dei tassi di crescita può potenzialmente comportare una distorsione della selezione. Come discusso in precedenza, i metodi che utilizzano WGA possono superare questa distorsione di selezione in quanto questa tecnica non si basa sull’espansione delle celle. Tuttavia, WGA ha le sue carenze, e l’amplificazione clonale rimane l’unico metodo per determinare con precisione il numero di mutazioni nell’intero genoma senza abbandoni allelici e una copertura equa lungo il genoma, soprattutto in campioni con bassa vera somatica numeri di mutazione.
I dati generati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati per determinare le filogenie del sistema ematopoietico, in quanto le mutazioni rilevate nelle singole cellule possono essere utilizzate per sezionare le linee cellulari, come illustrato nella Figura 6. In genere, una o due mutazioni possono definire ogni ramo in un donatore sano1. Poiché i lignaggi si ramificano all’inizio del concepimento, le mutazioni che definiscono questi primi rami saranno presenti anche con un vaF basso nel campione normale abbinato che è stato utilizzato per filtrare le varianti germinali1,18,19. In questo caso, l’uso di cellule non ematopoietiche, come le MSC, è preferito in quanto si prevede che si separino molto presto durante lo sviluppo dal sistema ematopoietico. Poiché le cellule T sono di origine ematopoietica, l’uso di queste cellule come campione normale corrispondente per filtrare le varianti germinali potrebbe quindi confondere la costruzione della prima ramificazione dell’albero di lignaggio dello sviluppo. La presenza subclonale di mutazioni specifiche dei rami in alcune popolazioni di sangue maturo, che può essere misurata mediante sequenziamento profondo mirato, indicherà che la progenie di quel ramo può dare origine a quel tipo di cellula matura. Inoltre, il nostro approccio consente di valutare le conseguenze mutazionali dell’esposizione mutagena in vivo e, in ultima analisi, di come ciò possa contribuire allo sviluppo della leucemia.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione VIDI dell’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (n. 016.Vidi.171.023) a R. v. B.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |