Summary

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Published: July 17, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un’implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

Abstract

Il metabolismo dei lipidi e la sua regolamentazione sono di interesse sia per le scienze della vita di base che per le biotecnologie applicate. A questo proposito, varie specie di lievito sono utilizzate come modelli nella ricerca metabolica dei lipidi o per la produzione industriale di lipidi. Le goccioline di lipidi sono corpi di archiviazione altamente dinamici e il loro contenuto cellulare rappresenta una comoda lettura dello stato metabolico lipidico. La microscopia a fluorescenza è un metodo di scelta per l’analisi quantitativa delle goccioline lipidiche cellulari, in quanto si basa su apparecchiature ampiamente disponibili e consente l’analisi delle singole goccioline lipidiche. Inoltre, l’analisi microscopica delle immagini può essere automatizzata, aumentando notevolmente la produttività complessiva dell’analisi. Qui descriviamo un flusso di lavoro sperimentale e analitico per il rilevamento automatizzato e la descrizione quantitativa delle singole goccioline di lipidi in tre diverse specie di lievito modello: i lieviti di fissione Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae. Le goccioline di lipidi vengono visualizzate con BODIPY 493/503 e il dextran fluorescente delle cellule viene aggiunto ai mezzi di coltura per aiutare a identificare i confini delle cellule. Le cellule sono sottoposte a microscopia dell’epiorescenza 3D nei canali verde e blu e le immagini z-stack risultanti vengono elaborate automaticamente da una pipeline MATLAB. La procedura emette dati quantitativi dettagliati sul contenuto di gocciolinie di lipidi cellulari e sulle caratteristiche delle singole gocce di lipidi in un formato tabulare adatto per analisi a valle in grandi fogli di calcolo o pacchetti statistici. Forniamo analisi di esempio del contenuto di goccioline lipidiche in varie condizioni che influenzano il metabolismo dei lipidi cellulari.

Introduction

I lipidi svolgono un ruolo cruciale nel metabolismo dell’energia cellulare e del carbonio, nella sintesi dei componenti della membrana e nella produzione di sostanze bioattive. Il metabolismo dei lipidi viene messo a punto in base alle condizioni ambientali, alla disponibilità di nutrienti e alla fase del ciclo cellulare1. Nell’uomo, il metabolismo dei lipidi è stato collegato a malattie, come l’obesità, il diabete di tipo II e il cancro2. Nell’industria, i lipidi prodotti da microrganismi, come i lieviti, rappresentano una fonte promettente di combustibili diesel rinnovabili3 . Le cellule immagazzinano lipidi neutri nelle cosiddette goccioline di lipidi (LD). Questi corpi evolutivamente conservati sono composti da triacylglycerols, steryl esters, un monostrato esterno di fosfolipidi e proteine associate1. Gli LD hanno origine nel reticolo endoplasmico, esercitano dinamiche del ciclo cellulare o della fase di crescita e sono importanti per l’omeostasi dei lipidi cellulari1. Il numero LD e la morfologia possono essere utilizzati come un comodo proxy quando si analizza il metabolismo dei lipidi in varie condizioni di crescita o durante lo screening di un gruppo di mutanti. Data la loro natura dinamica, tecniche in grado di analizzare le proprietà dei singoli LD sono di particolare interesse negli studi sul metabolismo dei lipidi.

Varie specie di lievito sono state utilizzate per descrivere le vie metaboliche legate ai lipidi e la loro regolazione, o utilizzate nella biotecnologia per produrre composti o combustibili interessanti1. Inoltre, per i lieviti modello, come il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae o il lievito di fissione lontano correlato Schizosaccharomyces pombe, sono disponibili librerie di deformazione di delezione a livello di genoma che possono essere utilizzati per schermi4,5. Recentemente la composizione e la dinamica LD sono state descritte in S. pombe6,7,8,9, e mutanti legati al metabolismo dei lipidi sono stati isolati nel lievito modello emergente Schizosaccharomyces japonicus10.

Sono disponibili numerose tecniche per studiare contenuti e dinamiche LD. La maggior parte impiega nodi di colorazione di LD con coloranti lipofili come Nile Red o BODIPY 493/503. Quest’ultimo mostra spettri di eccitazione ed emissione più stretti, e una maggiore specificità verso i lipidi neutri (LD) rispetto ai fosfolipidi (membrane)11. I metodi fluorimetrici e di citometria di flusso sono stati utilizzati con successo in varie specie fungine per scoprire geni e condizioni di crescita che influenzano il contenuto lipidico di immagazzinamento12,13,14,15. Sebbene questi metodi siano adatti per applicazioni ad alta produttività, non possono misurare i numeri e la morfologia dei singoli LD nelle cellule, che possono differire notevolmente tra le condizioni di crescita e i genotipi. La dispersione coerente Raman o la microscopia olografica digitale sono metodi privi di etichette che producono dati a livello di LD, ma richiedono attrezzature costose specializzate16,17,18. La microscopia a fluorescenza, d’altra parte, può fornire dati dettagliati sul contenuto LD, utilizzando al contempo strumenti di analisi delle immagini e strumenti software di analisi delle immagini comunemente disponibili. Esistono diversi flussi di lavoro di analisi che presentano vari gradi di sofisticazione e automazione nel rilevamento di celle/LD dai dati immagine e sono ottimizzati per diversi tipi di cellule, come le celle metazoiconiche con LD di grandi dimensioni19,20 , 21, o lieviti in erba17,22,23. Alcuni di questi approcci funzionano solo in 2D (ad esempio, su immagini di proiezione massima), che potrebbero non riuscire a descrivere in modo affidabile il contenuto LD cellulare. A nostra conoscenza, non esistono strumenti per la determinazione del contenuto di LD e la morfologia da dati microscopici di lievito di fissione. Lo sviluppo di analisi automatizzate e robuste a livello di LD porterebbe una maggiore sensibilità e una maggiore potenza statistica e fornirebbe informazioni dettagliate sul contenuto di lipidi neutri, idealmente in più specie di lieviti.

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per l’analisi dei contenuti LD da immagini di microscopia a fluorescenza 3D di cellule di lievito. Le celle vive sono colorate con BODIPY 493/503 e dextran Cascade Blue per visualizzare gli LD e determinare i limiti delle celle, rispettivamente. Le cellule sono immobilizzate su vetrini di vetro e sottoposte a imaging z-stack utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Le immagini vengono poi elaborate da una pipeline automatizzata implementata in MATLAB, un pacchetto (commerciale) ampiamente utilizzato per le analisi statistiche. La pipeline esegue la pre-elaborazione delle immagini, la segmentazione (celle e sfondo, la rimozione delle celle morte) e l’identificazione LD. I dati avanzati a livello Di LD, come le dimensioni LD e l’intensità della fluorescenza, vengono quindi forniti in un formato tabulare compatibile con i principali strumenti software per fogli di calcolo. Il flusso di lavoro è stato utilizzato con successo per determinare l’impatto della disponibilità della fonte di azoto sul metabolismo dei lipidi in S. pombe24. Ora dimostriamo la funzionalità del flusso di lavoro in S. pombe, S. japonicus e S. cerevisiae, utilizzando condizioni di crescita o mutanti che influenzano il contenuto lD cellulare.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni e mezzi di comunicazione Preparare la soluzione di colorazione dei lipidi. Per preparare la soluzione di colorazione dei lipidi di riserva sciogliere 10 mg di BODIPY 493/503 in 10 mL di anhydrous DMSO (concentrazione finale 1 mg/mL). Sciogliere l’intero contenuto di una fiala da 10 mg BODIPY 493/503 per evitare la perdita di materiale durante la pesatura.ATTENZIONE: DMSO può passare attraverso la pelle. Indossare attrezzature protett…

Representative Results

L’intera procedura è riassunta nella Figura 1 per i lieviti di fissione (il flusso di lavoro del lievito in erba è analogo), e di seguito forniamo esempi di come il flusso di lavoro può essere utilizzato per studiare il contenuto di LD in tre diverse specie di lievito in varie condizioni note per influire sul contenuto LD cellulare. Ogni esempio rappresenta un singolo esperimento biologico. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" sr…

Discussion

La comprensione del metabolismo dei lipidi e della sua regolazione è importante sia per la biologia di base che per le applicazioni cliniche e biotecnologiche. Il contenuto di LD rappresenta una comoda lettura dello stato del metabolismo dei lipidi della cellula, con la microscopia a fluorescenza uno dei principali metodi utilizzati per la determinazione del contenuto LD. Il protocollo presentato consente il rilevamento automatico e la descrizione quantitativa di singoli LD in tre specie di lievito diverse e morfologica…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da Charles University sovvenzioni PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Ringraziamo Ond’ej Ebesta per l’aiuto con la microscopia e lo sviluppo della pipeline di analisi delle immagini. Ringraziamo il laboratorio ReGenEx per i ceppi S. cerevisiae e il laboratorio di JapoNet e Hironori Niki per i ceppi S. japonicus. Il ceppo ppc1-88 è stato fornito dal Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopia è stata effettuata nel Laboratorio di microscopia confocale e fluorescenza cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale e dal bilancio statale della Repubblica ceca (Progetto n. 4.1.00/1.00/16.0347 e C.2.16/3.1.00/21515).

Materials

12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) – Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

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