Summary

Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo

Published: September 13, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l’isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.

Abstract

Il rhabdomyosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambini. Sebbene sforzi significativi abbiano permesso l’identificazione di mutazioni comuni associate al RMS e consentito la discriminazione di diversi sottotipi RMS, esistono ancora grandi sfide per lo sviluppo di nuovi trattamenti per migliorare ulteriormente la prognosi. Anche se identificato dall’espressione di marcatori miogenici, c’è ancora una controversia significativa sul fatto che RMS abbia origini miogeniche o non miogene, poiché la cellula di origine è ancora poco compresa. Nel presente studio, viene fornito un metodo affidabile per il saggio di biosfera per rms del topo. Il test si basa sulle proprietà funzionali delle cellule tumorali e consente l’identificazione di popolazioni rare nel tumore con funzioni tumorogene. Sono inoltre descritte le procedure per testare le proteine ricombinanti, integrare i protocolli di trasfezione con il test della biosfera e valutare i geni candidati coinvolti nello sviluppo e nella crescita del tumore. Descritto ulteriormente è una procedura per il trapianto di allotrapianto di sfere tumorali in topi riceventi per convalidare la funzione tumorale in vivo. Nel complesso, il metodo descritto consente l’identificazione e il test affidabili di popolazioni tumorigene RMS rare che possono essere applicate al RMS derivante in contesti diversi. Infine, il protocollo può essere utilizzato come piattaforma per lo screening farmacologico e lo sviluppo futuro delle terapie.

Introduction

Il cancro è una malattia eterogenea; inoltre, lo stesso tipo di tumore può presentare diverse mutazioni genetiche in pazienti diversi, e all’interno di un paziente un tumore è composto da più popolazioni di cellule1. L’eterogeneità rappresenta una sfida nell’identificazione delle cellule responsabili dell’avvio e della propagazione del cancro, ma la loro caratterizzazione è essenziale per lo sviluppo di trattamenti efficienti. La nozione di cellule che propagano il tumore (TPC), una rara popolazione di cellule che contribuiscono allo sviluppo del tumore, è stata precedentemente ampiamente rivista2. Nonostante il fatto che i TPC siano stati caratterizzati in più tipi di cancro, l’identificazione dei marcatori per il loro isolamento affidabile rimane una sfida per diversi tipi di tumore3,4,5,6 , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9.Così, un metodo che non si basa su marcatori molecolari, ma piuttosto sulle proprietà funzionali del TPC (alto auto-rinnovamento e la capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento), noto come analisi di formazione della tumorsfera, può essere ampiamente applicato per la l’identificazione dei TPC dalla maggior parte dei tumori. È importante sottolineare che questo saggio può anche essere impiegato per l’espansione dei TPC e quindi applicato direttamente allo screening farmacologico del cancro e agli studi sulla resistenza al cancro1,10.

Il rhabdomyosarcoma (RMS) è una rara forma di sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambinipiccoli 11. Althoug RMS può essere identificata istologicamente attraverso la valutazione dell’espressione dei marcatori miogenici, la cellula RMS di origine non è stata caratterizzata in modo univoco a causa dei sottotipi tumorali multipli e dell’alta eterogeneità degli stimoli dello sviluppo tumorale. Ineffetti, studi recenti hanno generato una significativa discussione scientifica sul fatto che RMS sia di origine miogenica o non miogenica, suggerendo che RMS possa derivare da diversi tipi di cellule a seconda del contesto12,13, 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17. Sono stati effettuati numerosi studi sulle linee cellulari RMS utilizzando il saggio di formazione della tumoresfera per l’identificazione delle vie coinvolte nello sviluppo tumorale e nella caratterizzazione dei marcatori associati a popolazioni altamente auto-rinnovate 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21.

Tuttavia, nonostante il potenziale del saggio di formazione della tumorsfera per identificare le cellule RMS di origine, non è ancora stato descritto un metodo affidabile che può essere impiegato nelle cellule RMS primarie. In questo contesto, un recente studio del nostro gruppo ha impiegato un analisi ottimizzata della formazione della tumorsfera per l’identificazione delle cellule RMS di origine in un modello murino Duchenne muscular dystrophy (DMD)22. Più tipi di cellule pre-tumorigene, isolate dai tessuti muscolari, sono testate per la loro capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento, consentendo l’identificazione delle cellule staminali muscolari come cellule di origine per RMS in contesti distrofici. Descritto qui è un protocollo riproducibile e affidabile per il saggio di formazione della forma della tumorsferae (Figura 1), che è stato impiegato con successo per l’identificazione di popolazioni cellulari estremamente rare che sono responsabili dello sviluppo del mouse RMS.

Protocol

L’alloggio, il trattamento e il sacrificio dei topi sono stati eseguiti in seguito al protocollo Approvato IACUC del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. 1. Preparazione del reagente Preparare 100 mL di supporti di isolamento cellulare: F10 medio integrato con 10% siero di cavallo (HS). Preparare 50 mL di soluzione di collagenasi di tipo II: sciogliere 1 g di polvere di collagenae di tipo II in 50 mL di supporto di isolamento cellulare (notare le unità dell’…

Representative Results

Rilevamento delle sfere tumoraliL’isolamento cellulare è stato ottimizzato per ottenere la massima eterogeneità delle popolazioni cellulari presenti nel tessuto tumorale. In primo luogo, poiché i tessuti isolati presentavano aree morfologicamente dissimili, per aumentare le possibilità di isolare le popolazioni di cellule rare uniformi, il campionamento è stato eseguito da più aree del tumore(Figura 1A, primo pannello a sinistra). I…

Discussion

Sono stati impiegati diversi metodi per l’isolamento e la caratterizzazione dei TPC dalle popolazioni cellulari eterogenee tumorali: saggi clonogenici tumorali, isolamento FACS e saggio di formazione della tumorsferae. L’asino clonogenico del tumore è stato descritto per la prima volta nel 1971, utilizzato per studi sulle cellule staminali, e solo successivamente applicato alla biologia del cancro29,30. Questo metodo si basa sulla proprietà intrinseca delle cel…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Ellison Medical Foundation AG-NS-0843-11, e dal NIH Pilot Grant all’interno del NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 ad A.S.

Materials

Accutase cell dissociation reagent Gibco A1110501 Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo Nexcelom Celigo Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II Life Technologies 17101015 Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease Life Technologies 17105041 Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media Gibco 11965092 Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media Gibco 11320033 Component of tumosphere media
EDTA ThermoFisher S312500 Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein Gibco PMG8041 Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry BD Biosciences 650033 Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent MWI Vet Supply 502017 Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain Life Technologies F10347 Discriminate live and dead cells
Goat Serum Life Technologies 16210072 Component of FACS buffer
Ham's F10 Media Life Technologies 11550043 Component of FACS buffer
Horse Serum Life Technologies 16050114 Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent ThermoFisher L3000015 Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix Corning CB40234 Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X) Gibco 17502048 Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment MWI Vet Supply 701008 Eyes ointment
PBS Gibco 10010023 Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1 Addgene 6084-1 GFP plasmid
Penicillin – Streptomyocin Life Technologies 15140163 Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic Peprotech 10018B Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 427-FL-005 Recombinant protein
Trypan blue ThermoFisher 15250061 Discriminate live and dead cells

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Citazione di questo articolo
Boscolo Sesillo, F., Sacco, A. Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas. J. Vis. Exp. (151), e59897, doi:10.3791/59897 (2019).

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