Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

La Divisione Cellulare è un processo critico per tutti gli organismi multicellulari, sia nel loro sviluppo che nell'omeostasi¹. La Drosophila è stata a lungo utilizzata come modello per lo studio della divisione cellulare, con esperimenti in vari tipi di tessuto e condizioni genetiche che forniscono informazioni chiave sul processo. Mentre molte di queste intuizioni provengono da condizioni cellulari fisse, la divisione cellulare è una procedura dinamica con molte parti in movimento, rendendo la visualizzazione delle cellule vive integrale alla valutazione degli effetti di RNAi o di knockout genetico su numerose parti della divisione cellulare, tra cui formazione di mandrini, congresso cromosomico e segregazione, e citocinesi.

Molti protocolli sono stati sviluppati e utilizzati nel corso degli anni per visualizzare le divisioni cellulari della Drosophila in vivo. Vari gruppi hanno coltivato tecniche per l'immagine divisioni in entrambi i dischi larvali e cervelli larvali^{2,3,4,5,6,7,8} . Queste tecniche, sebbene utili per l'imaging in tessuti specifici, sono limitate nella produttività e spesso richiedono la generazione e il mantenimento di scorte genetiche per generare componenti fluorescenti e alterare l'espressione di geni di interesse. Le cellule S2 coltivate della Drosophila forniscono un'alternativa più elevata alla produttività per testare rapidamente gli effetti di vari geni nella divisione cellulare. Inoltre, con la capacità di trasfecare varie proteine fluorescenti, le cellule S2 possono essere rapidamente modificate per determinare gli effetti del knockdown RNAi su numerosi componenti della divisione cellulare. I geni fluorescenti di interesse possono essere osservati anche nella divisione cellulare, consentendo una caratterizzazione dinamica della loro funzione⁹.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging dal vivo delle cellule Mitotiche S2 utilizzando metodi che abbiamo recentemente descritto¹⁰. Il nostro metodo utilizza cellule trascate stabilmente con marcatori fluorescenti per microtubuli e centrimeri la cui espressione è sotto il controllo di un promotore inducibile di rame (metallothionein; pMT). Questa metodologia può essere utilizzata per immagini dinamiche del mandrino e del cromosoma in tutte le fasi della mitosi utilizzando un microscopio fluorescente relativamente semplice con un software di imaging di base. Può essere ulteriormente personalizzato per soddisfare le esigenze di ricerca individuali, con la trasfezione transitoria e l'RNAi che offre possibilità ampliate per determinare il ruolo dei geni candidati nella mitosi. A causa della relativa semplicità del protocollo, può essere utilizzato per schermi di perdita di funzione su piccola scala per identificare i geni per i quali sarebbe utile un ulteriore studio in vivo, consentendo sforzi e efficienza più mirati con i successivi manipolazione nelle mosche.

1. Preparazione delle cellule S2 per il trattamento con RNAi

1. Da una coltura stock di cellule s2 confluenti di pMT:GFP:CID e pMT:mCherry: z-tubulina stabilmente trasincate cellule S2 (-80% vitale; coltivate a 24-28 gradi C), le cellule di semi in una piastra di coltura di 6 well welle ad una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL in siero bovino fresco, riscaldato, 10% di bovine (FBS) integrato i supporti per insetti di Schneider (SIM).
   NOTA: le cellule S2 trascantate in modo stly possono essere generate seguendo un protocollo del DrSC https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells (DrSC) di Drosophila RNAi Anche se la specifica linea stabile S2 utilizzata nel presente documento utilizza GFP e mCherry, esistono numerose alternative sia all'interno di questi spettri fluorescenti che in altri. Una discussione dettagliata di queste proteine fluorescenti esula dall'ambito di questo protocollo, ma le loro proprietà e i potenziali vantaggi/svantaggi sono stati sapientemente rivisti altrove ¹¹.
   1. Utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro, determinare la densità dello stock di cellule confluenti.
   2. Determinare il volume di sospensione cellulare confluente necessario per ottenere 1 x 10⁶ celle / mL in un volume totale di 4 mL (ad es., 4 x 10⁶ celle totali). Aggiungere questo volume di stock di celle a un volume di SIM fresca per fare 4 mL / volume totale di pozzi. Determinare la densità dello stock di cellule (celle/mL) diluindo 100 l di cellule direttamente dal pallone di riserva con 100 L di supporti e contando questa diluizione 1:2 manualmente con un emocitometro o con un contatore di celle automatico, se disponibile.
      NOT: Se si utilizzano cellule S2 non trattate stabilmente, può essere eseguito un effetto transitorio di trasfezione con tag fluorescenti (GFP, mCherry, ecc.) e un marcatore di DNA (CENP-A, Histone H2B, ecc.) e un marcatore di DNA (CENP-A, Histone H2B, ecc.). Inoltre, linee cellulari opportunamente trascate con vari spindle mitotico e marcatori di DNA sono disponibili presso il Drosophila Genetics Resource Center che può meglio soddisfare le esigenze sperimentali esatte dell'utente (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
   3. Collocare le cellule appena semiate in un'incubatrice a 24-28 gradi centigradi per 36-48 h.

2. Trattamento delle cellule di semi con dsRNA contro i geni di interesse

NOT: L'esempio seguente e la sezione Results useranno Shortstop (Shot), un agente che collega l'atto-microtubulo come gene di interesse. Utilizzare un trattamento fittizio senza dsRNA o con dsRNA diretto contro un gene irrilevante (ad esempio, beta-galactosidase, lacà) come controllo negativo.

1. I mezzi di insetto di Warm Schneider non integrati con FBS (Sirum free media; in cubatrice 24-28 gradi centigradi.
2. Trasferire le cellule dal pozzo precedentemente seminato (dal punto 1.1.2) in un tubo sterile da 15 mL, notando il volume totale delle cellule trasferite.
   1. Conservare un piccolo volume di celle (100 dollari l) per il conteggio in un contatore di cellule o in un emocitometro.
3. Pellere delicatamente le cellule centrifugondo a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
   1. Durante la centrifugatura delle cellule, determinare la concentrazione di cellule per mL utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Moltiplicare questo numero per il volume totale centrifugato (notato in 1.2.2.) per ottenere il numero totale di cellule.
4. Aspirare il supernatale dalle cellule pellete.
5. Sospendere nuovamente le cellule nella SFM riscaldata per ottenere una concentrazione di 3 x 10⁶ cellule/mL.
   1. Trasferire 1 mL delle celle risospese in un nuovo pozzo in un pozzo 6.
6. Aggiungete 10-50 g di dsRNA (diluito in 100 gradi di acqua senza RNAase) contro Shot (o il gene bersaglio di interesse) direttamente alle cellule e girano la piastra per mescolare. Incubano la piastra per 1 h nell'incubatrice a 24-28 gradi per consentire l'assorbimento diretto del dsRNA nelle cellule.
7. Durante l'incubazione di 1 h, riscaldare la SIM integrata 10% FBS nell'incubatrice 24-28 gradi centigradi.
8. Dopo aver incubato cellule con dsRNA per 1 h, aggiungere 2 mL di 10 % FBS integrato SIM direttamente al pozzo senza rimuovere il 1 mL di supporto.
9. Collocare le cellule in incubatrice a 24-28 gradi centigradi per 3-7 giorni.
   NOT: Come per la concentrazione di dsRNA, potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo totale del trattamento per il gene bersaglio desiderato. Per valutare l'efficacia dell'RNAi, eseguire una macchia occidentale sull'intero lisato cellulare utilizzando un anticorpo contro il gene bersaglio. Se la sequenza di destinazione iniziale del dsRNA si rivela inefficace, progettare dsRNA alternativi mirati a sequenze uniche all'interno del gene bersaglio.

3. Induzione dell'espressione proteica fluorescente e preparazione delle cellule per l'imaging

1. Se cellule trattate stabilmente sono state generate utilizzando il plasmide pMT (contenente un inducibile metallothionein promotor) come descritto qui, indurre l'espressione di proteine fluorescenti trattando le cellule con solfato di rame (CuSO₄) ad una concentrazione finale di 500 M per 24-36 h prima dell'imaging e 4 giorni dopo il trattamento dell'RNAi. L'uso di plasmidi di espressione coniugale come pAct non richiede l'induzione del rame.
2. Preparare le celle per l'imaging
   1. Riscaldare la SIM integrata fBS al 10% nell'incubatrice 24-28 gradi centigradi per 1 h.
   2. Trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 mL, notando il volume totale delle cellule trasferite.
      1. Conservare un piccolo volume di celle (100 dollari l) per il conteggio in un contatore di cellule o in un emocitometro.
   3. Pellere delicatamente le cellule centrifugondo a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
      1. Durante la centrifugatura delle cellule, determinare la concentrazione (cellule/mL) utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Moltiplicare questo numero per il volume totale centrifugato (notato in 2.2.2.) per ottenere il numero totale di cellule.
   4. Aspirare il supernatale dalle cellule pellete.
   5. Risospendere le cellule in fresco, riscaldato 10% FBS integrato SIM per ottenere una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule / mL. Aggiungere una quantità appropriata di CuSO₄ per mantenere una concentrazione di 500 M.
   6. Trasferire 200-500 l di cellule ri-sospese in un pozzo di una camera a cellule vive multi-bene e posizionarle al microscopio fluorescente invertito. Lasciare che le cellule si stabilizzino nella camera per 15-30 minuti prima degli esperimenti di imaging.
      NOT: I pozzi della camera a cellule vive possono essere prerivestiti con poli-L-lisina per un'ulteriore aderenza.

4. Impostare un programma Live Cell Imaging

NOT: Live Cell Imaging in questo esperimento è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging invertito e il relativo software (ad esempio, Olympus IX83 con il pacchetto software cellSens Dimensions). I dettagli saranno diversi dal produttore del microscopio e dal pacchetto software; pertanto, le linee guida e le operazioni generali sono elencate di seguito.

1. Utilizzando il software che esegue il microscopio fluorescente invertito, preparare un programma per l'imaging di una cellula (o cellule) nel tempo.
   1. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del desktop del software.
   2. Creare un nuovo file sperimentale facendo clic su File, quindi su Nuovo filesperimentale .
   3. In primo luogo, inserire un ciclo di time lapse su cui verranno scattate le immagini. A tale scopo, fare clic sull'icona Del cronometro (iconaLoop Time-lapse) dalla barra delle icone. Impostare l'intervallo in s nella scheda Gestione esperimenti, quindi impostare il numero di cicli nella stessa scheda dividendo la lunghezza complessiva dell'esperimento desiderata (in s) per l'intervallo. Lasciare che il ciclo si ripeta nel periodo di tempo totale desiderato.
      NOT: Tipicamente, le immagini vengono scattate ogni 30-60 s in un periodo di 3-4 h.
   4. All'interno del livello del ciclo di intervallo di tempo, inserire un controllo di messa a fuoco a infrarossi per mantenere la messa a fuoco dell'obiettivo (se disponibile). A tale scopo, aggiungere un passaggio di compensazione di z-drift (DC) all'interno del livello Ciclo Time-lapse facendo clic sull'icona Quadrato con due frecce (Sposta XY icona) e selezionando Compensazione di deriva da z dal menu a discesa.
      NOT: Il termine controllo di messa a fuoco a infrarossi si riferisce a un sistema mediante il quale un impulso infrarosso viene utilizzato per mantenere una distanza costante tra l'obiettivo e la camera di scorrimento /imaging. Molti microscopi hanno un tale sistema, ognuno con la propria nomenclatura proprietaria. I lettori devono consultare il manuale operativo o il rappresentante per informazioni di denominazione specifiche.
   5. Dopo il controllo della messa a fuoco a infrarossi, aggiungere un passaggio nel programma per eseguire un'immagine multicanale (ad esempio, FITC per GFP e TRITC per mCherry) su un 3-5 z-stack inserendo prima un passo dello stack z, quindi specificando il canale. A tale scopo, aggiungere un livello Gruppo multicanale all'interno del livello loop Time-lapse facendo clic sull'icona Ruota colore (iconaGruppo multicanale). Successivamente, aggiungere un livello Loop di stack z all'interno del livello Gruppo multicanale facendo clic sull'icona a 3 livelli (icona Loopstack z). Impostare le dimensioni del passo e il numero di sezioni desiderate nella scheda Gestione esperimenti e impostare l'esposizione di ogni canale il più basso possibile per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
      NOT: L'intervallo z-stack, il tempo di esposizione e la percentuale di trasmissione per i LED possono variare. Tipico in questi esperimenti, utilizzare tre z-stack assunti su un intervallo di 3 m, dando un intervallo di 1 m tra ogni pila. Definire il centro della cella piuttosto che la parte superiore e inferiore tende a portare ai migliori risultati. Le immagini vengono quindi raccolte per ogni canale a un'esposizione di 50 ms e una percentuale di trasmissione del 50% senza filtro a densità neutra (ND).

5. Immagine dividendo le celle utilizzando il programma di imaging delle celle dal vivo

NOT: Le cellule S2 non richiedono CO₂ e crescono in modo ottimale a 23-27 gradi centigradi. Tutte le immagini sono state eseguite a temperatura ambiente in una stanza ben controllata.

1. Utilizzando l'oculare, trovare l'angolo superiore (o inferiore) del pozzo e mettere a fuoco l'obiettivo (40-60x immersione dell'olio) sulle cellule utilizzando il canale mCherry (z-tubulin).
2. Eseguire la scansione lungo la parte superiore (o inferiore) del pozzo per allontanarsi dal divisore del pozzo verticale.
   NOT: L'imaging troppo vicino ai divisori di pozzo può interferire con i controlli di messa a fuoco infrarossi.
3. Trovare una cella (o cellule) che si trovano nella fase M2 o nella fase M iniziale.
   NOT: Queste cellule possono essere meglio identificate con l'esistenza di esattamente due strutture di microtubuli "stella-like" (centrisomi) e un nucleo intatto (indicato da una regione circolare di luce rifratta all'interno della cellula), entrambe facilmente distinguibili usando la z-tubulina (rosso) filtro di eccitazione. La selezione delle cellule nella precedente interfase, notevole da uno o zero centrosoni facilmente visibili, può causare uno spredamenti di tempo a causa di un ritardo nella progressione G2/M. Al contrario, la selezione delle cellule dopo il NEBD impedirà un calcolo accurato della temporizzazione mitotica e l'imaging dell'assemblaggio precoce del mandrino e delle dinamiche cromosomiche. Inoltre, le cellule S2 spesso contengono >2 centrosomi. Anche se questi tipicamente cluster in un mandrino bipolare¹², si consiglia agli utenti di evitare queste cellule se non diversamente voluto per la progettazione sperimentale. Le immagini e la discussione delle celle appropriate da selezionare sono disponibili nella sezione Risultati rappresentativi.
4. Fate clic sul pulsante Vista Dal vivo per iniziare a visualizzare le celle nella schermata del software. Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine del microscopio, mettere a fuoco la cellula (o le cellule) di interesse. Impostare il controllo della messa a fuoco a infrarossi facendo clic sul pulsante Imposta messa a fuoco.
5. Avviare il programma di imaging time lapse facendo clic sul pulsante Start. Regolare gli istogrammi in base alle esigenze selezionando il canale desiderato e regolando l'intensità media dei pixel per vedere chiaramente la cella (o le celle) di interesse.
6. Consentire l'esecuzione del programma, controllando la cella dopo 15-20 min per garantire che si sia verificata la rottura dell'involucro nucleare (NEBD), che è determinata dalla scomparsa del buio rotondo, un punto rifratto vicino al centro della cella.
7. Continuare a consentire l'esecuzione del programma, controllando in modo intermittente (ogni 15-20 min) per determinare una volta che si è verificato l'insorgenza dell'anafase. Arrestare il programma a questo punto se c'è più tempo rimanente nel periodo di tempo totale e salvare il file. In alternativa, se gli eventi durante la telofase e la citochina sono di interesse, consentire al programma di eseguire un tempo sufficiente per visualizzare anche questi processi.
8. Eseguire l'analisi del NEBD alla temporizzazione dell'esordio anaphase notando il tempo di NEBD (t_NEBD) in min e il tempo di separazione cromosomica iniziale (t_{anaphase insorgenza}) in min e sottraendo t_NEBD dall'insorgenza di t_anaphase per ottenere NEBD all'anaphase tempo di insorgenza per una determinata cella.
   1. A tale scopo, fare clic sul pulsante fotogramma e annotare i fotogrammi in cui si verificano l'insorgenza di NEBD e anaphase, sottraendoli per determinare il numero totale di fotogrammi di scaduta e moltiplicandolo per l'intervallo di tempo tra i fotogrammi di imaging.
9. Continuare la scansione per le celle di pre-divisione per ottenere più n per una determinata condizione. Le cellule possono essere immagini nel pozzo della camera della cella animata fino a 12 h dopo il loro assestamento iniziale.

I metodi che descriviamo sopra porteranno all'identificazione e all'imaging delle cellule della Drosophila S2 sottoposte a divisione cellulare. Le cellule che stanno per dividersi (cioè, poco prima di entrare nella fase M) possono essere prese di mira dalla presenza di due centrisomi e da un nucleo intatto indicato dalla luce rifratta e da un punto più scuro all'interno della cella quando vengono visualizzati nel canale z-tubulina (Figura 1, pannelli più a sinistra, canale rosso; freccia nella figura 1A). Stimiamo che circa il 2-5% delle cellule rientri in questa categoria, e tra esperimenti di imaging, di solito passiamo un massimo di 2-3 minuti a scansionare per un'altra cella qualificata. NEBD può essere visualizzato attraverso la scomparsa di questa macchia scura, con conseguente colorazione uniforme del citoplasma (Figura 1, pannelli contrassegnati "00:00", rosso). Dopo la NEBD, il tempo che ogni cellula impiega per formare il mandrino, i cromosomi congressuali e separare i cromosomi può essere misurato semplicemente notando i punti temporali di questi eventi rispetto al NEBD.

Utilizziamo queste divisioni per valutare la tempistica mitotica, in particolare di NEBD per l'insorgenza dell'anaphase, notando il punto in cui i cromosomi iniziano a separarsi. La maggioranza (90%) di cellule indotte dal rame, espresse sia mCherry:z-tubulina che GFP:CID. Una piccola percentuale di celle (10%) espresso solo un marcatore o nessuno dei due. Queste cellule sono state evitate durante la selezione delle cellule. In genere, le celle S2 visualizzano NEBD per anaphase insorgenza di tempi compresi tra 20-30 minuti (Figura1A, Controllo). Successivamente abbiamo trattato le cellule con dsRNA mirate contro Shortstop (Shot), una proteina che collega l'atto-microtubulo che sospettavamo possa influenzare la dinamica del ciclo cellulare. Infatti, a seguito di cellule a seguito di Shot knockdown cellule hanno mostrato un significativo ritardo mitotico (Figura 1B, ShotRNAi ritardo), con molte cellule arresto in metafase e mai la transizione ad anaphase durante l'intero esperimento di imaging 2-3 ore (Figura 1D, Arresto di ShotRNAi). Abbiamo motivato questo fenotipo di ritardo/arresto potrebbe essere probabilmente dovuto all'attivazione del checkpoint di assemblaggio del mandrino (cioè il checkpoint della fase M). Per testare direttamente questa ipotesi, abbiamo co-trattato le cellule con dsRNA contro Colpo e Rough deal (Rod), una componente importante di questo checkpoint13. Ciò ha portato a una soppressione del fenotipo di arresto, con conseguente NEBD a tempi di anaphase simili al controllo (Figura 1C, ShotRNAi-RodRNAi). Così, questo protocollo di imaging dal vivo ci ha permesso di concludere che Shot è necessario per la progressione tempestiva della fase M e che la sua perdita porta all'attivazione del checkpoint che ritarda o arresta le cellule mitotiche.

Figura 1: l'imaging dinamico dinamico rivela i difetti del ciclo cellulare dovuti all'attivazione del checkpoint mitotico nelle celle S2.
In tutte le condizioni, l'imaging a cellule vive è stato condotto su cellule S2 co-trascate stabilmente con GFP:CID inducibile e mCherry: (A) I cartoni animati illustrano importanti punti di riferimento durante la mitosi, e le immagini corrispondenti sono mostrate da filmati rappresentativi di genotipi indicati con punti temporali relativi a NEBD (t-00:00) indicati. Le celle di controllo in genere avanzano verso l'anafase entro 20-30 min. Le cellule trattate con ShotRNAi mostrano un ritardo NEBD-anaphase (B) e spesso subiscono l'arresto della metafase, senza mai entrare in anaphase all'interno dell'esperimento di imaging (D). Il co-trattamento delle cellule con ShotRNAi e RodRNAi, un componente del checkpoint di assemblaggio del mandrino, sopprime il fenotipo Shot che porta alla cinetica ad esordio anaphase simile alle cellule di controllo (C). Le frecce in (A) indicano le strutture centrosomere 'stella-like' e la grande punta della freccia indica il nucleo. Ogni barra della scala rappresenta 5 micron. Questa cifra viene adattata e ripubblicata con il permesso di10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Filmato time-lapse della divisione cellulare S2 di controllo. Il video mostra un filmrappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'Controllo'. Questo filmato corrisponde alla figura 1A. Questo video è adattato e ripubblicato con il permesso da10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Filmato time-lapse della divisione cellulare S2 ritardata 'ShotRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi' che porta a un ritardo mitotico fenotipica. Questo filmato corrisponde alla figura 1B. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Film time-lapse della divisione cellulare S2 'ShotRNAi'RodRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi'RodRNAi'. Questo filmato corrisponde alla figura 1C. Questo video è adattato e ripubblicato con il permesso da10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Film time-lapse della divisione cellulare S2 arrestata 'ShotRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi' che porta ad un arresto mitotico fenotipica. Questo filmato corrisponde alla figura 1D. Clicca qui per scaricare questo video.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.