Il muscolo di volo della Drosophila è un modello potente per studiare la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo con etichettafluere fluorescente dalle pupe vive per generare campioni altamente arricchiti ideali per la proteomica e il sequenziamento profondo. Questi campioni possono offrire importanti approfondimenti meccanicistici su diversi aspetti dello sviluppo muscolare.
Il muscolo di volo della Drosophila è un potente modello per studiare processi diversi come la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia, che influenzano tutti lo sviluppo muscolare e la mioribrillogenesi. I dati omici, come quelli generati dalla spettrometria di massa o dal sequenziamento profondo, possono fornire importanti informazioni meccanicistiche su questi processi biologici. Per tali approcci, è utile analizzare campioni specifici dei tessuti per aumentare sia la selettività che la specificità delle impronte digitali omiche. Qui presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo fluorescente dalle pupe vive per generare campioni muscolari altamente arricchiti per applicazioni omiche. Descriviamo innanzitutto come sezionare i muscoli di volo nelle prime fasi puiche (48 h APF) o degli adulti, quando i muscoli sono distinguibili al microscopio dissezioso. Il protocollo video di accompagnamento renderà queste dissezioni tecnicamente impegnative più ampiamente accessibili alle comunità di ricerca muscolari e della Drosophila. Per le applicazioni dell’RNA, esaminiamo la quantità e la qualità dell’RNA che può essere isolata in diversi momenti temporali e con approcci diversi. Dimostriamo inoltre che Bruno1 (Bru1) è necessario per uno spostamento temporale nello splicing della catena pesante della miosina(Mhc),dimostrando che i muscoli sezionati possono essere utilizzati per mRNA-Seq, spettrometria di massa e reazione a catena di trascrittorione inversa (RT-PCR) Applicazioni. Questo protocollo di dissezione contribuirà a promuovere analisi omiche specifiche dei tessuti e può essere generalmente applicato per studiare molteplici aspetti biologici della miogenesi.
Le moderne tecnologie omiche forniscono importanti informazioni sullo sviluppo muscolare e sui meccanismi alla base dei disturbi muscolari umani. Ad esempio, l’analisi dei dati relativi alla trascrittomica combinata con la verifica genetica e biochimica nei modelli animali ha rivelato che la perdita del fattore di giunzione RBM20 causa cardiomiopatia dilatata a causa della sua regolamentazione di una rete target di oltre 30 sarcomere geni precedentemente associati a malattie cardiache, tra cui titin1,2,3.
In un secondo esempio, studi di coltura cellulare, modelli animali e pazienti umani hanno dimostrato che la distrofia miotonica è causata da un’interruzione della regolazione dell’RNA a causa del sequestro di Muscleblind (MBNL) e dall’upregulation di CELF14,5. Le dinamiche interregolatorie e temporali tra MBNL e CELF1 (chiamate anche CUGBP1 o Bruno-Like 2) aiutano a spiegare i persistenti modelli di giunzione embrionale nei pazienti con distrofia miotonica. Inoltre, la vasta rete di bersagli malregolamentati aiuta a spiegare la natura complessa della malattia4,6,7,8. La maggior parte di questi studi utilizza approcci omici negli organismi modello genetico per comprendere i meccanismi alla base della malattia muscolare umana. Inoltre, evidenziano l’importanza di comprendere prima l’espressione genica temporale e tissutale specifica, la modificazione delle proteine e i modelli metabolici nel muscolo sano per comprendere le alterazioni nel muscolo malato o invecchiamento.
La Drosophila melanogaster è un altro organismo modello genetico ben consolidato. La struttura del sarcomero e dei singoli componenti sarcomeri sono altamente conservati dalle mosche ai vertebrati4,9,10, e i muscoli indiretti di volo (IFM) sono diventati un potente modello da studiare molteplici aspetti dello sviluppo muscolare11,12. In primo luogo, i muscoli di volo fibrillar sono funzionalmente e morfologicamente distinti dai muscoli tubolari del corpo11,13, consentendo lo studio di meccanismi di sviluppo specifici di tipo muscolare. Fattori di trascrizione tra cui Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) e Homothorax (Hth)15 sono stati identificati come regolatori del destino fibrillare. Inoltre, a valle di Salm, l’omologa CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programma di giunzione specifico per fibrillare16,17.
In secondo luogo, gli IFM sono un modello importante per comprendere il processo stesso della miogenesi, dalla fusione del mioblasto e l’attaccamento del miotubo alla miofibrillogenesi e alla maturazione sarcomere9,18,19. In terzo luogo, la genetica della Drosophila consente di studio i contributi di singole proteine, domini proteici e isoforme proteiche alla formazione, alla funzione e alle proprietà biofisiche20,21,22 ,23. Infine, sono stati sviluppati modelli IFM per lo studio di molteplici disturbi muscolari umani, come distrofia miotonica, miocellio, disturbi degenerativi muscolari, actinopatie, ecc.24,25,26 ,27, e hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi della malattia e sulle potenziali terapie28,29,30. Così, la Drosophila è un modello utile per affrontare molte questioni aperte nel campo della miogenesi, compresi i meccanismi di trascrizione specifica di tipo muscolare, splicing e regolazione della cromatina, così come al ruolo del metabolismo nello sviluppo muscolare. L’applicazione delle moderne tecnologie omiche, in particolare in combinazione con l’ampia varietà di analisi biologiche genetiche, biochimiche e cellulari disponibili in Drosophila,ha il potenziale per far progredire drasticamente la comprensione dei muscoli sviluppo, invecchiamento e malattia.
Gli IFM sono i muscoli più grandi della mosca, che si estende per quasi 1 mm su tutta la lunghezza del torace negli adulti31,32. Tuttavia, questa piccola dimensione genera la sfida di ottenere un campione sufficiente per applicare le tecnologie omiche nella Drosophila in modo specifico. Inoltre, gli IFM fanno parte della muscolatura adulta che si forma durante le fasi pupali. I mioblasti si fondono per formare miotubi, che si attaccano ai tendini circa 24 h dopo la formazione del puparium (APF) e subiscono un passo di compattazione necessario per avviare la miofibrillogenesi intorno a 30 h APF (Figura 1A-D)18,33, 34.
Le miofibre poi crescono fino a coprire l’intera lunghezza del torace, con miofibrille in fase di crescita iniziale focalizzata sull’aggiunta di sarcomero fino a circa 48 h APF, per poi passare a una fase di maturazione, in cui i sarcomecomeres crescono in lunghezza e larghezza e sono rimodellato per stabilire l’attivazione dell’estensione di 72 h APF (Figura 1A-D)32,35. L’insorgenza della maturazione della fibra è controllata almeno in parte da Salm ed E2F32,36,37,e molteplici isoforme proteiche sarcomere specifiche IFM la cui giunzione è controllata da Bru1 sono incorporate durante questo fase16,17. Le mosche mature schiudono da 90-100 h APF. Ciò significa che per studiare lo sviluppo muscolare, IFM deve essere isolato con sufficiente quantità, qualità e purezza da più tempi pupali per facilitare l’analisi utilizzando approcci omici.
Sono stati pubblicati diversi protocolli per la dissezione IFM. Sebbene questi protocolli funzionino bene per le applicazioni previste, nessuno è ideale per gli approcci omici. I protocolli che conservano la morfologia IFM per immunofluorescenza degli IFM pupali e adulti19, isolano le fibre IFM per la valutazione meccanica31o utilizzano la microdissezione dell’IFM pupalo da criosezioni38 sono troppo specializzati e manodopera per ottenere ragionevolmente quantità sufficienti di tessuto IFM per applicazioni omiche. Altri protocolli sono stati sviluppati per la rapida dissezione di IFM38,39 , specificamente adulti,39, quindi non sono applicabili alle fasi puidiche e utilizzano buffer che non sono ideali o possono essere incompatibili con, ad esempio, l’isolamento dell’RNA. Pertanto, è necessario sviluppare nuovi approcci per isolare l’IFM pupalo per applicazioni biochimiche o omiche.
Qui presentiamo un protocollo per la dissezione di IFM durante le fasi pupali che è stato utilizzato con successo per l’analisi mRNA-Seq da 16 h APF attraverso gli stadi adulti16,32. Il protocollo impiega un’etichetta verde di proteine fluorescenti (GFP) per identificare gli IFM in tutte le fasi dello sviluppo pupa e adulto, consentendo la dissezione dal vivo al microscopio di dissezione fluorescente. L’approccio è meno laborioso, con una velocità effettiva superiore rispetto ai protocolli di dissezione IFM esistenti. Ciò consente un rapido isolamento e crioconservazione dei campioni, generando abbastanza materiale dopo diversi cicli di dissezione per gli approcci omici nonché per la reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa standard (RT-PCR) o gonfiore occidentale.
Vi presentiamo il protocollo in due parti, dimostrando come sezionare rapidamente IFM sia prima di 48 h APF (durante la metamorfosi precoce, quando gli allegati IFM sono più tenui) e dopo 48 h APF (quando il piano del corpo pupali e gli allegati IFM sono ben definiti). Dimostriamo che possiamo isolare l’RNA di alta qualità dagli IFM sezionati in tutti i momenti e presentare i dati sui diversi approcci all’isolamento dell’RNA e alla trascrizione inversa. Infine, dimostriamo l’applicazione del protocollo di dissezione a mRNA-Seq, spettrometria di massa e RT-PCR usando l’omologa CELF1 Bruno1 come esempio. Mostriamo la mancata espressione delle isoforme proteiche sarcomere nei dati proteomici di Bruno1 mutant IFM ed esaminiamo la regolazione Bruno1 dell’evento di giunzione del terminale C della catena pesante Myosin (Mhc). Questi risultati illustrano come i dati omici possono fornire una comprensione più profonda dei fenomeni biologici, integrando esperimenti genetici e biochimici.
In questo protocollo, presentiamo la tecnica di base per sezionare gli IFM della Drosophila dalle pupe in fase avanzata e tardiva per l’isolamento a valle di proteine, DNA, RNA o altre macromolecole. Il protocollo può essere facilmente adattato per sezionare IFM da mosche adulte. Dimostriamo l’utilità del nostro protocollo di dissezione per applicazioni mRNA-Seq, proteomica e RT-PCR. Con il continuo miglioramento delle tecnologie omiche per consentire l’analisi di campioni con meno materiale di partenza e concentrazioni di ingresso inferiori, queste dissezioni diventeranno probabilmente preziose per molte applicazioni aggiuntive. Poiché gli IFM sono un modello consolidato per le miopatie umane4,24 e sviluppo specifico di tipo muscolare9,12, prevediamo, ad esempio, metabolomica arricchita di IFM, indagini sulla conformazione della cromatina tramite 3C o 4C, splicing network evaluation via CLiP interazioni o fosfo-proteomica della miofibrillogenesi.
È importante considerare che queste dissezioni producono un campione arricchito per IFM invece di un campione IFM puro. Questo è inevitabile a causa dell’innervazione del neurone motorio, degli attacchi tendini e dell’invasione tracheale delle fibre muscolari. L’analisi bioinformatica può essere utilizzata per identificare geni o proteine arricchite da IFM, ma sono necessari ulteriori esperimenti per dimostrare che sono in realtà specifici di IFM. La purezza del campione può essere analisi utilizzando marcatori specifici del tessuto pubblicati come Stripe45 (tend), Act79B4,44 (muscolo tubolare), Act88F15 (IFM) o syb46 (specifico neuronale). Potrebbe essere possibile utilizzare tali marcatori per normalizzare i set di dati in base al contenuto specifico di IFM, ma gli utenti sono avvertiti che i cambiamenti temporali nell’espressione dei geni utilizzati per la normalizzazione, ad esempio dei geni specifici di IFM o della tubulina, possono pregiudicare tale approccio.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di etichettatura specifica del tessuto codificati geneticamente, ad esempio l’etichettatura CE47,48 o49,50 per isolare l’RNA, il che può contribuire a campione di RNA specifico del tessuto. Tuttavia, il marcatura CE richiede l’alimentazione costante delle mosche47 e pertanto non è applicabile durante le fasi pupali. La sensibilità e la completezza dei trascrittomi con etichetta PABP possono avere limitazioni51. Gli approcci FACS per isolare le singole fibre muscolari sono complicati dalle grandi dimensioni e dalla natura sinciziale degli IFM. INTACT52,53 approcci di stile possono essere applicati per isolare specifici compartimenti subcellulari dagli IFM, che possono rivelarsi utili per isolare le popolazioni pure di nuclei IFM o mitocondri. Le dissezioni manuali sono ancora lo standard attuale per ottenere tessuto IFM intatto per la maggior parte delle applicazioni a valle.
La qualità del campione dipende da diversi passaggi critici del processo di dissezione. Le dissezioni sono tecnicamente impegnative, con la velocità di dissezione e la purezza del campione che aumenta con l’esperienza. Il dissezione per brevi periodi di tempo (20-30 min) in tamponamento refrigerato senza detersivo e congelo immediato aiuta a preservare l’integrità del campione, come è stato osservato in precedenza per l’isolamento del tendine del topo54. Gli IFM possono essere congelati a secco dopo aver rimosso tutto il buffer dal pellet, ma in particolare per l’isolamento dell’RNA, il congelamento dei campioni nel buffer di isolamento tende a produrre risultati migliori. Gli IFM da un massimo di 20 dissezioni separate vengono combinate prima dell’isolamento dell’RNA o delle proteine, consentendo il ridimensionamento e la raccolta di materiale sufficiente, anche dai primi tempi o mutanti16,32, per l’analisi a valle.
Per le applicazioni dell’RNA, il passo più critico può essere l’isolamento dell’RNA stesso. Il gelidio thiocyanate-phenol-chloroformio (metodo 1 sopra) supera la maggior parte dei kit commerciali testati e, come osservato in precedenza, è considerevolmente meno costoso55. La variabilità osservata nei rendimenti di isolamento dell’RNA con kit commerciali è in accordo con le precedenti osservazioni56,57. Aggiungiamo ulteriormente il glicogeno durante le precipitazioni isopropanolo per aiutare a recuperare tutto l’RNA. Oltre alla resa dell’RNA, è importante verificare l’integrità dell’RNA per garantire che il campione non sia stato frammentato o degradato durante i processi di dissezione e isolamento. È inoltre essenziale lavorare senza RNase. Infine, la scelta di RT-kit può influire sulla sensibilità del processo di trascrizione inversa. Anche se non spesso discusso in dettaglio, tutti questi punti influenzano la qualità del campione IFM e i dati ottenuti dalle applicazioni a valle.
Diverse importanti modifiche distinguono il protocollo dai protocolli di dissezione IFM esistenti. Sebbene esista un protocollo di dissezione dettagliato per l’immunofluorescenza IFM19, questo protocollo presenta un approccio diverso alle dissezioni puupali che consente un più rapido isolamento del tessuto IFM. Ciò consente la raccolta di grandi quantità di tessuto IFM (relativamente parlando) con tempi di dissezione limitati per prevenire cambiamenti di proteoma o trascrittoma. Altri protocolli descrivono la dissezione dell’IFM adulto per visualizzare la colorazione GFP nelle singole miofibrille39 o per la colorazione dei muscoli larvali della parete del corpo58, ma non affrontano la dissezione nelle fasi puiche o per l’isolamento di RNA o proteina. Questo approccio è anche distinto dal protocollo esistente per la microdisezione degli IFM pupali da criosezioni38, che può generare un campione IFM più puro, ma è più laborioso e produce meno materiale. Rispetto ad altri protocolli rapidi di dissezione IFM adulti38,39, IFM sono isolati in PBS buffer senza detersivo per limitare l’induzione dello stress e altre principali modifiche di espressione.
Il progresso chiave di questo protocollo è l’inclusione di un reporter vivo e fluorescente, che consente l’isolamento degli IFM nelle prime fasi pupali. Usiamo standardmente Mef2-GAL459 alla guida UAS-CD8::GFP o UAS-GFP::Gma60. Ciò consente l’etichettatura differenziale di IFM (i muscoli del volo sono più fortemente etichettati e dalla forma diversa rispetto ad altri muscoli pupali) così come le prestazioni delle manipolazioni basate su GAL4-UAS, ad esempio gli esperimenti di salvataggio o RNAi. È anche possibile combinare Mef2-GAL4 con tub-GAL80ts per evitare la letalità precoce associata all’RNAi o con UAS-Dcr2 per aumentare l’efficienza dell’RNAi40.
Sono disponibili driver GAL4 o GFP aggiuntivi che variano in termini di specificità del tipo di muscolo, modello di espressione temporale e forza del driver19,61 che possono essere utilizzati al posto di Mef2-GAL4. Ad esempio, Act88F-GAL4 viene prima espresso intorno a 24 h APF, quindi non può essere utilizzato per timepoint precedenti; tuttavia, etichetta fortemente IFM e può essere utile per evitare la letalità precoce associata all’RNAi. Lui-GFP o Act88F -Etichetta GFPIFM, sempre con restrizioni temporali, ma evitano la dipendenza GAL4 di espressione marcatore e può essere utile in combinazione con un background mutante di interesse. Sono disponibili elenchi di altre possibili linee di marker19. Va anche notato che l’uso di transgeni e del sistema GAL4/UAS può causare artefatti di espressione genica, quindi è importante utilizzare controlli appropriati, ad esempio la linea di guida attraversata per la deformazione di fondo di tipo selvaggio, in modo che tali artefatti siano presumibilmente lo stesso in tutti i campioni.
Con il video di accompagnamento, questo protocollo dettagliato mira a rendere più accessibile la dissezione IFM pulatale e promuovere l’uso di approcci omici per studiare lo sviluppo muscolare. L’accoppiamento del potere della genetica della Drosophila e della biologia cellulare con i saggi di biochimica e omica accessibili attraverso l’IFM sezionato ha il potenziale per far progredire la comprensione meccanicistica della miogenesi e delle funzioni muscolari. Studi futuri che collegano le osservazioni a livello di sistemi della regolazione del trascrittoma e del proteoma alle uscite metaboliche e funzionali forniranno una comprensione più profonda dello sviluppo specifico del tipo muscolare e della patogenesi dei disturbi muscolari.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati ad Andreas Ladurner e Frank Schnorrer per il generoso sostegno. Ringraziamo Sandra Esser per l’eccellente assistenza tecnica e Akanksha Roy per aver generato i dati della spettrometria di massa. Riconosciamo i centri di borsa Bloomington e Vienna per la fornitura di mosche. Ringraziamo il Core Facility Bioimaging per l’aiuto con l’imaging confocale e il Proteinanalytik di .entrallabor per l’analisi dei campioni di spettrometria di massa, entrambi presso il Centro Biomedico LMU (Martinsried, DE). Il nostro lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), dal Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) presso la Ludwig-Maximilians-University M’nchen (MLS), dal Frederich-Bauer Stiftung (MLS) e dall’International Max Scuola di ricerca Planck (EN).
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |