Summary

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

Published: January 07, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l’attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Abstract

La persistente risposta infiammatoria all’uso di un biomateriale impiantato, noto come reazione del corpo estraneo, è una sfida significativa nello sviluppo e nell’implementazione di dispositivi biomedici e costrutti di ingegneria tissutale. I macrofagi, una cellula immunitaria innata, sono attori chiave nella reazione del corpo estraneo perché rimangono nel sito dell’impianto per tutta la durata del dispositivo e sono comunemente studiati per comprendere questa risposta dannosa dell’ospite. Molti ricercatori di biomateriali hanno dimostrato che gli strati proteici adsorbiti sui materiali impiantati influenzano il comportamento dei macrofafi e successivamente influenzano la risposta dell’ospite. I metodi di questo documento descrivono un modello in vitro utilizzando strati proteici adsorbiti contenenti molecole di danno cellulare su superfici biomateriali polimeriche per valutare le risposte dei macrofagi. Una linea cellulare di macrofasi reporter nF-B/AP-1 e l’addetto altest alcalino metrico sono stati utilizzati come metodo rapido per esaminare indirettamente l’attività del fattore di trascrizione NF-B/AP-1 in risposta a complessi strati proteici adsorbiti contenenti proteine ematiche e modelli molecolari associati ai danni, come modello dei complessi strati proteici adsorbenti formati sulle superfici biomateriali in vivo.

Introduction

La reazione del corpo estraneo (FBR) è una risposta cronica dell’ospite che può influire negativamente sulle prestazioni di un materiale o dispositivo impiantato (ad esempio, dispositivi di somministrazione di farmaci, biosensori), attraverso il rilascio persistente di mediatori infiammatori e impedendo l’integrazione tra il materiale impiantato e il tessuto circostante1. Questa risposta immunitaria innata è iniziata dalla procedura di impianto ed è caratterizzata dalla presenza a lungo termine di cellule immunitarie innate e formazione di capsule fibrose intorno all’impianto1. Nel contesto delle risposte materiali dell’ospite, le interazioni macrofago-materiale hanno un impatto significativo sulla progressione della risposta dell’ospite e sullo sviluppo di un FBR1. I macrofagi sono una popolazione di cellule immunitarie innate diversificata, reclutate nel sito dell’impianto sia da popolazioni di macrofagi residenti in tessuto che dal sangue come macrofagi derivati da monociti. Iniziano ad accumularsi nel sito dell’impianto poco dopo l’impianto e in pochi giorni diventano la popolazione cellulare predominante nel microambiente dell’impianto. I macrofagi aderenti ai materiali, insieme alle cellule giganti del corpo estraneo (FBGC) formate attraverso la fusione dei macrofagi, possono persistere sulla superficie materiale per tutta la durata dell’impianto2,3. Di conseguenza, i macrofagi sono considerati attori chiave nella risposta del corpo estraneo a causa dei loro ruoli orchestrando i passi caratteristici della FBR: risposta infiammatoria acuta, rimodellamento dei tessuti e formazione del tessuto fibrotico1.

I recettori a pedaggio (TLR) sono una famiglia di recettori di riconoscimento dei pattern che sono espressi da molte cellule immunitarie, tra cui i macrofagi, e hanno dimostrato di svolgere un ruolo significativo nell’infiammazione e nella guarigione delle ferite. Oltre ai ligandi di derivazione patogena, i TLR sono in grado di legare molecole endogene, note come modelli molecolari associati a i danni (DAMP), che vengono rilasciate durante la necrosi cellulare e attivano vie di segnalazione infiammatoria con conseguente produzione di citochine infiammatorie4. Noi e altri abbiamo proposto che i danni subiti durante le procedure di impianto dei biomateriali dei tessuti molli rilasciano DAMP, che poi adsorbisce alle superfici biomateriali oltre alle proteine del sangue e modulano le successive interazioni cellula-materiale5,6. Quando i macrofagi interagiscono con lo strato proteico adsorbito su un impianto, i loro TLR di superficie possono riconoscere i DAMP adsorbiti e attivare le cascate di segnalazione infiammatorie, portando all’attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-1 e alla produzione di citochine proinfiammatorie. In precedenza abbiamo dimostrato che i macrofagi murini hanno aumentato significativamente l’attività di NF-B/AP-1 e il fattore di necrosi tumorale citochina infiammatoria) secrezione in risposta agli strati proteici adsorbiti contenenti DAMP su una varietà di superfici polimeriche rispetto alle superfici con siero adsorbito o solo plasma (cioè, nessun DAMP presente), e che questa risposta è in gran parte mediata da TLR2, mentre TLR4 svolge un ruolo minore5.

La linea cellulare macrofagia del reporter NF-B/AP-1 (Tabella dei materiali) utilizzata in questo protocollo è un metodo conveniente per misurare l’attività relativa NF-B e AP-1 nei macrofagi5,7,8. In combinazione con gli inibitori della via TLR, questa linea cellulare è uno strumento utile per studiare l’attivazione della TLR e il suo ruolo nell’infiammazione in risposta a una varietà di stimoli5,7,8. Le cellule del reporter sono una linea cellulare modificata simile a un macrofago murino che può produrre stabilmente fosfosate alcalina embrionale (SEAP) su attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-19. Il saggio di fosfofosate alcalina enzimatica colorimetrica (Tabella dei materiali) può quindi essere utilizzato per quantificare quantità relative di espressione SEAP come misura indiretta dell’attività NF-B/AP-1. Poiché le molecole di adattatore NF-B e AP-1 sono a valle di molte vie di segnalazione cellulare, è possibile neutralizzare anticorpi e inibitori mirati a TLR specifici (ad esempio, TLR2) o molecole di adattatore TLR (ad esempio MyD88) per verificare il ruolo di una via specifica. La metodologia descritta in questo articolo fornisce un approccio semplice e rapido per valutare il contributo della segnalazione TLR nelle risposte murine dei macrofafi a una varietà di superfici polimeriche con strati proteici adsorbiti contenenti sia proteine ematiche che DAMP come modello in vitro di biomateriali impiantati.

Protocol

1. Preparazione dei supporti e dei reagenti Preparare i supporti fibroblasti. Unire 450 mL di Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), 50 mL di siero bovino fetale (FBS) e 5 mL di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi. Preparare i media di crescita del macrofago reporter in aliquote da 50 mL. Unire 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS, 5 reagente di eliminazione del micoplasma/mL(Tabella dei materiali) e 200 fleomycin D1 (Tabella dei materia…

Representative Results

Sono stati testati metodi di pulizia per le superfici rivestite di polimeri per garantire che non vi fosse alcuna interruzione del rivestimento, che sarebbe stato visto come un cambiamento dell’angolo di contatto con l’acqua a una vetrina di vetro non rivestita (Figura 2). L’immergenza di vetrini al microscopio rivestiti pmMA in 70% etanolo per 1 h è stato trovato per rimuovere il rivestimento PMMA (Figura 2, pannello sinistro), probabilmente a causa della solu…

Discussion

Uno degli obiettivi principali del nostro laboratorio è la risposta dell’ospite agli impianti di tessuti molli biomateriali solidi, e in particolare il modo in cui il danno cellulare subito durante la procedura di impianto influisce sulla risposta dell’ospite. Il lavoro qui presentato descrive gli esperimenti preliminari utilizzando una linea cellulare del macrofago reporter e il lisa cellulare contenente DAMP generato in vitro, per studiare l’influenza delle molecole rilasciate durante i danni cellulari (cioè dalla ch…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento operativo del Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), del Queen’s University Senate Advisory Research Committee e del sostegno alle infrastrutture della Canadian Foundation for Innovation John Evan’s Leadership Fund (Project 34137) e del Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Progetto 34137). L.A.M. è stato sostenuto da una Queen’s University R. Samuel McLaughlin Fellowship, da un Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada Canadian Graduate Scholarship Master’s Award e da una borsa di studio Ontario Graduate. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Myron Szewczuk per il suo generoso dono della linea cellulare macrofagio reporter NF-B/AP-1 e i dottori Michael Blennerhassett e Sandra Lourenssen per l’uso del loro sistema di imaging gel e lettore di placche.

Materials

Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

Riferimenti

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Play Video

Citazione di questo articolo
McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

View Video