Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l’attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.
La persistente risposta infiammatoria all’uso di un biomateriale impiantato, noto come reazione del corpo estraneo, è una sfida significativa nello sviluppo e nell’implementazione di dispositivi biomedici e costrutti di ingegneria tissutale. I macrofagi, una cellula immunitaria innata, sono attori chiave nella reazione del corpo estraneo perché rimangono nel sito dell’impianto per tutta la durata del dispositivo e sono comunemente studiati per comprendere questa risposta dannosa dell’ospite. Molti ricercatori di biomateriali hanno dimostrato che gli strati proteici adsorbiti sui materiali impiantati influenzano il comportamento dei macrofafi e successivamente influenzano la risposta dell’ospite. I metodi di questo documento descrivono un modello in vitro utilizzando strati proteici adsorbiti contenenti molecole di danno cellulare su superfici biomateriali polimeriche per valutare le risposte dei macrofagi. Una linea cellulare di macrofasi reporter nF-B/AP-1 e l’addetto altest alcalino metrico sono stati utilizzati come metodo rapido per esaminare indirettamente l’attività del fattore di trascrizione NF-B/AP-1 in risposta a complessi strati proteici adsorbiti contenenti proteine ematiche e modelli molecolari associati ai danni, come modello dei complessi strati proteici adsorbenti formati sulle superfici biomateriali in vivo.
La reazione del corpo estraneo (FBR) è una risposta cronica dell’ospite che può influire negativamente sulle prestazioni di un materiale o dispositivo impiantato (ad esempio, dispositivi di somministrazione di farmaci, biosensori), attraverso il rilascio persistente di mediatori infiammatori e impedendo l’integrazione tra il materiale impiantato e il tessuto circostante1. Questa risposta immunitaria innata è iniziata dalla procedura di impianto ed è caratterizzata dalla presenza a lungo termine di cellule immunitarie innate e formazione di capsule fibrose intorno all’impianto1. Nel contesto delle risposte materiali dell’ospite, le interazioni macrofago-materiale hanno un impatto significativo sulla progressione della risposta dell’ospite e sullo sviluppo di un FBR1. I macrofagi sono una popolazione di cellule immunitarie innate diversificata, reclutate nel sito dell’impianto sia da popolazioni di macrofagi residenti in tessuto che dal sangue come macrofagi derivati da monociti. Iniziano ad accumularsi nel sito dell’impianto poco dopo l’impianto e in pochi giorni diventano la popolazione cellulare predominante nel microambiente dell’impianto. I macrofagi aderenti ai materiali, insieme alle cellule giganti del corpo estraneo (FBGC) formate attraverso la fusione dei macrofagi, possono persistere sulla superficie materiale per tutta la durata dell’impianto2,3. Di conseguenza, i macrofagi sono considerati attori chiave nella risposta del corpo estraneo a causa dei loro ruoli orchestrando i passi caratteristici della FBR: risposta infiammatoria acuta, rimodellamento dei tessuti e formazione del tessuto fibrotico1.
I recettori a pedaggio (TLR) sono una famiglia di recettori di riconoscimento dei pattern che sono espressi da molte cellule immunitarie, tra cui i macrofagi, e hanno dimostrato di svolgere un ruolo significativo nell’infiammazione e nella guarigione delle ferite. Oltre ai ligandi di derivazione patogena, i TLR sono in grado di legare molecole endogene, note come modelli molecolari associati a i danni (DAMP), che vengono rilasciate durante la necrosi cellulare e attivano vie di segnalazione infiammatoria con conseguente produzione di citochine infiammatorie4. Noi e altri abbiamo proposto che i danni subiti durante le procedure di impianto dei biomateriali dei tessuti molli rilasciano DAMP, che poi adsorbisce alle superfici biomateriali oltre alle proteine del sangue e modulano le successive interazioni cellula-materiale5,6. Quando i macrofagi interagiscono con lo strato proteico adsorbito su un impianto, i loro TLR di superficie possono riconoscere i DAMP adsorbiti e attivare le cascate di segnalazione infiammatorie, portando all’attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-1 e alla produzione di citochine proinfiammatorie. In precedenza abbiamo dimostrato che i macrofagi murini hanno aumentato significativamente l’attività di NF-B/AP-1 e il fattore di necrosi tumorale citochina infiammatoria) secrezione in risposta agli strati proteici adsorbiti contenenti DAMP su una varietà di superfici polimeriche rispetto alle superfici con siero adsorbito o solo plasma (cioè, nessun DAMP presente), e che questa risposta è in gran parte mediata da TLR2, mentre TLR4 svolge un ruolo minore5.
La linea cellulare macrofagia del reporter NF-B/AP-1 (Tabella dei materiali) utilizzata in questo protocollo è un metodo conveniente per misurare l’attività relativa NF-B e AP-1 nei macrofagi5,7,8. In combinazione con gli inibitori della via TLR, questa linea cellulare è uno strumento utile per studiare l’attivazione della TLR e il suo ruolo nell’infiammazione in risposta a una varietà di stimoli5,7,8. Le cellule del reporter sono una linea cellulare modificata simile a un macrofago murino che può produrre stabilmente fosfosate alcalina embrionale (SEAP) su attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-19. Il saggio di fosfofosate alcalina enzimatica colorimetrica (Tabella dei materiali) può quindi essere utilizzato per quantificare quantità relative di espressione SEAP come misura indiretta dell’attività NF-B/AP-1. Poiché le molecole di adattatore NF-B e AP-1 sono a valle di molte vie di segnalazione cellulare, è possibile neutralizzare anticorpi e inibitori mirati a TLR specifici (ad esempio, TLR2) o molecole di adattatore TLR (ad esempio MyD88) per verificare il ruolo di una via specifica. La metodologia descritta in questo articolo fornisce un approccio semplice e rapido per valutare il contributo della segnalazione TLR nelle risposte murine dei macrofafi a una varietà di superfici polimeriche con strati proteici adsorbiti contenenti sia proteine ematiche che DAMP come modello in vitro di biomateriali impiantati.
Uno degli obiettivi principali del nostro laboratorio è la risposta dell’ospite agli impianti di tessuti molli biomateriali solidi, e in particolare il modo in cui il danno cellulare subito durante la procedura di impianto influisce sulla risposta dell’ospite. Il lavoro qui presentato descrive gli esperimenti preliminari utilizzando una linea cellulare del macrofago reporter e il lisa cellulare contenente DAMP generato in vitro, per studiare l’influenza delle molecole rilasciate durante i danni cellulari (cioè dalla ch…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento operativo del Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), del Queen’s University Senate Advisory Research Committee e del sostegno alle infrastrutture della Canadian Foundation for Innovation John Evan’s Leadership Fund (Project 34137) e del Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Progetto 34137). L.A.M. è stato sostenuto da una Queen’s University R. Samuel McLaughlin Fellowship, da un Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada Canadian Graduate Scholarship Master’s Award e da una borsa di studio Ontario Graduate. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Myron Szewczuk per il suo generoso dono della linea cellulare macrofagio reporter NF-B/AP-1 e i dottori Michael Blennerhassett e Sandra Lourenssen per l’uso del loro sistema di imaging gel e lettore di placche.
Cell culture reagents | |||
anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
Kits and assays | |||
ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
Polymeric coating reagents | |||
Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
Consumables | |||
Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |