Summary

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l’immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.

Abstract

Dalle sottili alterazioni comportamentali alla demenza in fase avanzata, il danno vascolare si sviluppa in genere a seguito di ischemia cerebrale. L’ictus e l’arresto cardiaco sono malattie sessualmente dimorfiche, ed entrambi inducono l’ischemia cerebrale. Tuttavia, i progressi nella comprensione del danno vascolare vascolare, e quindi nello sviluppo di trattamenti specifici per il sesso, sono stati in parte limitati dalle sfide nello studio della microcircolazione cerebrale dai modelli murini negli studi funzionali. Qui, presentiamo un approccio per esaminare la segnalazione capillary-to-arteriola in una preparazione capillary-ppillaryle capillary-parenchymic (HiCaPA) ex vivo ippocampale -parenchymal (HiCaPA) dal cervello di topo. Descriviamo come isolare, cannulare e pressurizzare la microcircolazione per misurare il diametro arteriolare in risposta alla stimolazione capillare. Mostriamo quali controlli funzionali appropriati possono essere utilizzati per convalidare l’integrità di preparazione HiCaPA e visualizzare risultati tipici, tra cui il test del potassio come agente di accoppiamento neurovascolare e l’effetto dell’inibitore recentemente caratterizzato della famiglia di canali di potassio rettificante interno Kir2, ML133. Inoltre, confrontiamo le risposte nei preparati vinti da topi maschi e femmine. Mentre questi dati riflettono le indagini funzionali, il nostro approccio può essere utilizzato anche negli studi di biologia molecolare, immunochimica ed elettrofisiologia.

Introduction

La circolazione pial sulla superficie del cervello è stata oggetto di molti studi, in parte a causa della sua accessibilità sperimentale. Tuttavia, la topologia della vascolatura cerebrale crea regioni distinte. In contrasto con la solida rete di pial ricca di anastomosi con notevole capacità di reindirizzare il flusso sanguigno, le arteriole parenchimale intracerebrali (PA) presentano un approvvigionamento collaterale limitato, ognuno dei quali perfonde un volume discreto di tessuto nervoso1,2. Questo crea un effetto di collo di bottiglia sul flusso sanguigno che, combinato con caratteristiche fisiologiche uniche3,4,5,6,7,8, rende arteriole intracerebrali un sito cruciale per la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF)9,10. Nonostante le sfide tecniche inerenti all’isolamento e alla cannosazione delle PA, l’ultimo decennio ha visto un crescente interesse per gli studi ex-vivo utilizzando navi pressurizzate11,12,13,14,15,16,17. Uno dei motivi di questo maggiore interesse è il notevole sforzo di ricerca condotto sull’accoppiamento neurovascolare (NVC), il meccanismo che sostiene l’iperemia funzionale del cervello18.

A livello regionale, CBF può aumentare rapidamente a seguito di attivazione neurale locale19. I meccanismi cellulari e le proprietà di segnalazione che controllano la NVC sono incompleti. Tuttavia, abbiamo identificato un ruolo precedentemente imprevisto per i capillari cerebrali durante NVC nel percepire l’attività neurale e tradurla in un segnale elettrico iperpolarizzante per dilatare arteriolea a monte20,21,22. Potenziale di azione23,24 e l’apertura di grande conduttanza Ca2 ,attivato K(BK) canali sui piedi di posta astrociti25,26 aumentare la concentrazione di ioni di potassio interstiziale [K]o, che si traduce in attivazione di forte rettificatore interiore K(Kir) canali nell’endotelio vascolare dei capillari. Questo canale è attivato da Kesterno, ma anche dall’iperpolarizzazione stessa. Diffondendosi attraverso giunzioni gap, la corrente iperpolarizzante poi si rigenera in cellule endoteliali capillari adiacenti fino all’arteriolo, dove provoca il rilassamento del miocito e l’aumento della CBF20,21. Lo studio di questo meccanismo ci ha portato a sviluppare una preparazione capillare-parenchymal arteriola (CaPA) pressurizzata per misurare il diametro arteriolare durante la stimolazione capillare con agenti vasoattivi. La preparazione CaPA è composta da un segmento di arteriole intracerebrale cannulato con una ramificazione capillare intatta a valle. Le estremità capillari sono compresse sul fondo del vetro della camera da una micropipetta, che occia e stabilizza l’intera formazione vascolare20,21.

In precedenza abbiamo fatto innovazioni strumentali da imaging Preparati CaPA dalla corteccia del topo20,21 e arteriole dal ratto amigdala13 e ippocampo16,17. Poiché la vascolatura dell’ippocampa riceve maggiore attenzione a causa della sua suscettibilità alle condizioni patologiche, qui forniamo un metodo passo-passo per la preparazione del CaPA dall’ippocampo del topo (HiCaPA) che può essere utilizzato non solo negli studi funzionali NVC, ma anche nella biologia molecolare, nell’immunochimica e nell’elettrofisiologia.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università del Colorado, Anschutz Medical Campus e sono stati eseguiti secondo le linee guida del National Institutes of Health. 1. Soluzioni Utilizzare la salina tampone MOPS per la dissezione e conservare i campioni a 4 gradi centigradi prima del loro utilizzo. Non gas la soluzione. Preparare la salina tamponata tamponata MOPS con la seguente composizione: 135 mM NaCl, 5 mM KCl…

Representative Results

Icanali diconducono conduzione endoteliale di piccole endoterie (SK) e di conduzione intermedia (IK) Ca2,sensibili a K, esercitano un’influenza dilatoria sul diametro delle PA. L’applicazione del bagno di 1 -M NS309, un agonista sintetico IK e SK canale, causato dilatazione quasi massima (Figura 2A,B). Tuttavia, le cellule endoteliali capillari mancano di canali IK e SK e non hanno iperpolarizzato in risposta a NS309<sup…

Discussion

La preparazione pressurizzata HiCaPA (ippocampo capillary-parenchymal arteriole) descritta nel presente manoscritto è un’estensione della nostra procedura consolidata per isolare, pressurizzare e studiare arteriole parenchymal29. Recentemente abbiamo riferito che Kir2.1 canali in cervello capillare cellule endoteliali senso aumenta in [K]o associato con l’attivazione neurale, e generare un segnale iperpolarizzante ascendente che dilata arterioles a monte20<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Jules Morin per commenti approfonditi sul manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dai premi dell’organizzazione non-profit CADASIL Together We Have Hope, del Center for Women’s Health and Research e della NHLBI R01HL136636 (FD).

Materials

0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).

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