Summary

Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Published: June 23, 2020
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l’intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Abstract

Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2′,7′-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l’incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell’intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.

Introduction

Tre principali specie reattive dell’ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l’anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno1. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare1. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui infiammazione, cancro, e malattia neurodegenerativa2,3,4.4 Lo scopo di questo metodo è quello di determinare il ROS cellulare totale nelle cellule aderenti utilizzando la colorazione di diattato (DCFH-DA) di 2′,7′-diclorodiidrofluorescein (DCFH-DA). La logica è che l’ossidazione del DCFH-DA al 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento totale2del ROS, compresi i radicali idrossili (OH) e il biossido di azoto ( . Meccanicamente, DCFH-DA è occupato da cellule dove cellulare all’espegnimento dei fendi fuori i gruppi di acetil, con conseguente DCFH. L’ossidazione di DCFH da parte di ROS converte la molecola in DCF, che emette fluorescenza verde ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 530 nm. Rispetto al rilevamento della fluorescenza con citometria di flusso e altri metodi alternativi5, i vantaggi di questo metodo utilizzando un microscopio a fluorescenza e un lettore di lamiere sono che produce immagini fluorescenti chiaramente visibili, ed è facile da eseguire, efficiente e conveniente. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per rilevare ROS cellulare per studiare varie condizioni6,7,8. Questo protocollo viene utilizzato per rilevare ros totale nelle cellule aderenti. L’utilizzo di questo metodo per rilevare ROS nelle celle delle sospensioni potrebbe richiedere alcune modifiche.

Protocol

1. Semina delle cellule Seme 2 x 105 cellule tumorali dell’HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi. Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h. 2. Preparazione della soluzione DCFH-DA Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO)…

Representative Results

Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo7. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l’assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L’intensità quantificata della fluorescenza è stata significa…

Discussion

Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l’esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l’ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health (K01DK114390), un sussidio di ricerca dell’American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), una sovvenzione per il progetto di progetto pilota di ricerca University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), un Shared Resources Pilot Project Award e un Research Program Support Pilot Project Award del centro oncologico globale UNM (P30CA118100) , e un nuovo premio ricercatore dal Dedicated Health Research Funds presso la Scuola di Medicina dell’Università del Nuovo Messico.

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

Riferimenti

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
  4. Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
  5. Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
  6. Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
  7. Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
  8. Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
  9. Kruger, N. J., Walker, J. M. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
  11. Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
  12. Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).

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Citazione di questo articolo
Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

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