Summary

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Published: January 25, 2020
doi:

Summary

Presentiamo un protocollo per l’immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Abstract

Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d’altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all’interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.

Introduction

Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche1,2,3,4. VWF è un sensore di flusso naturale che aggrega le piastrine nei siti ferita dei vasi sanguigni con tassi di taglio anomali e modelli di flusso. Lo srotolamento di VWF è essenziale per attivare l’associazione delle piastrine al dominio A1 e il binding del collagene al dominio A3. Inoltre, l’elevata diffusione del dominio A2 indotto dalla cesoia consente la scissione di VWF, che regola la sua distribuzione del peso molecolare in circolazione5,6. Pertanto, la visualizzazione diretta di come queste molecole si comportano sotto il flusso può migliorare notevolmente la nostra comprensione fondamentale della loro biomeccanica e funzione, che a sua volta può consentire nuove applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

Le metodologie tipiche per caratterizzare le conformazioni a singola molecola includono pinzette ottiche/magnetiche, microscopia a forza atomica (AFM) e trasferimento di energia a risonanza di rete (FRET)7a singola molecola. La spettroscopia a forza singola è un potente strumento per studiare la forza e il movimento associati ai cambiamenti conformazionali delle biomolecole. Tuttavia, manca la capacità di mappare le conformazioni molecolari complessive8. AFM è in grado di imaging ad alta risoluzione spaziale, ma è limitato nella risoluzione temporale9,10. Inoltre, il contatto tra la punta e il campione può confondere la risposta indotta dal flusso. Altri metodi come FRET e nanoporanalytics determinano gli stati di ripiegamento e dispiegamento delle proteine a singola molecola in base al rilevamento della distanza intramolecolare e dei volumi esclusi. Tuttavia, questi metodi sono ancora nella loro infanzia e limitati nella loro osservazione diretta di conformazioni a singola molecola11,12,13,14.

D’altra parte, osservare direttamente le macromolecole ad alta risoluzione temporale e spaziale nell’ambito della microscopia a fluorescenza ha migliorato la nostra comprensione della dinamica a singola molecola in molti processi biologici15,16. Ad esempio, Fu et al. ha recentemente raggiunto la visualizzazione simultanea dell’allungamento del VWF e del legame del recettore delle piastrine per la prima volta. Nel loro lavoro, le molecole VWF sono state immobilizzate sulla superficie di un canale microfluidico attraverso interazioni biotina-streptavidine e immagini sotto microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) in diversi ambienti di flusso di taglio17. Applicando un metodo simile a quello di Fu, qui dimostriamo che le conformazioni del VWF e del DNA lambda possono essere osservate direttamente sia nella microscopia TIRF che confocale a fluorescenza. Come illustrato nella Figura 1,i dispositivi microfluidici vengono utilizzati per creare e controllare il flusso di taglio e le biomolecole vengono immobilizzate sulla superficie del canale. Al momento dell’applicazione di tassi di taglio variabili, le conformazioni della stessa molecola vengono registrate per misurare la lunghezza dell’estensione, mostrata anche nella Figura 1. Il metodo potrebbe essere ampiamente applicato per esplorare altri comportamenti polimerici in ambienti di flusso complessi per studi reologici e biologici.

Protocol

1. Preparazione di VWF Ricostituire il VWF plasma umano per prepararlo alle reazioni di etichettatura. Aggiungete 100 l’l di acqua deionizzata (DI) a 100 g di VWF liofilizzato per creare una soluzione di stock da 1 mg/mL VWF. Dialyze Soluzione di stock VWF al fine di rimuovere l’eccesso di glicina, aumentando così l’efficienza di etichettatura della biotina e del fluoroforo. Trasferire 50 l di VWF in un’unità di dialisi da 0,1 ml con un taglio e guarnizione di peso molecolare di 10.000 unit?…

Representative Results

Osservare il comportamento dinamico di biomolecole come VWF e DNA lambda dipende fortemente dall’ottimizzazione del loro legame alla superficie del dispositivo. L’incubazione di trattamenti superficiali per i tempi raccomandati nel dispositivo microfluidico è fondamentale per ottenere il legame con alcuni punti di ancoraggio, in modo che le molecole possano estendere liberamente e rilassarsi al momento del flusso mutevole. Se le proteine o il DNA sono legati troppo fortemente con più collegamenti, si estenderanno a lun…

Discussion

Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra l…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della National Science Foundation DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 e AI133634, e finanziamenti interni della Lehigh University.

Materials

Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

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