Summary

Visualizzazione e analisi delle arterie dell'arco faringo utilizzando immunohistochimica a monte intero e ricostruzione 3D

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare e analizzare le arterie dell’arco faringeo 3, 4 e 6 degli embrioni di topo usando immunofluorescenza a montaggio intero, radura dei tessuti, microscopia confocale e ricostruzione 3D.

Abstract

La formazione o il rimodellamento improprio delle arterie dell’arco faringeo (PAA) 3, 4 e 6 contribuiscono ad alcune delle forme più gravi di malattia cardiaca congenita. Per studiare la formazione di PAA, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza immunofluorescenza a montaggio intero accoppiato con la radura del tessuto alcool/benzyl benzoate (BABB) e la microscopia confocale. Ciò consente la visualizzazione dell’endotelio dell’arco faringeo ad una risoluzione cellulare fine e la connettività 3D della vascolatura. Utilizzando il software, abbiamo stabilito un protocollo per quantificare il numero di cellule endoteliali (EC) nelle PAA, così come il numero di EC all’interno del plesso vascolare che circonda i PAA all’interno degli archi pharyngeal 3, 4 e 6. Se applicata all’intero embrione, questa metodologia fornisce una visualizzazione completa e un’analisi quantitativa della vascolatura embrionale.

Introduction

Durante l’embriogenesi del topo, le arterie dell’arco fantasma (PAA) sorgono come coppie simmetriche e bilaterali di arterie che collegano il cuore con le aortae dorsali1. Man mano che l’embrione si sviluppa, la prima e la seconda coppia di PAA regrediscono, mentre le 3rd,4the 6PAA subiscono una serie di eventi di rimodellamento asimmetrici per formare le arterie dell’arco aortico2.

I PAA 3, 4 e 6 si sviluppano attraverso la vasculogenesi, che è la formazione de novo dei vasi sanguigni3. I difetti nella formazione o nel rimodellamento di queste arterie ad arco danno origine a vari difetti cardiaci congeniti, come quelli osservati nei pazienti con sindrome di DiGeorge4,5. Pertanto, comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo dei PAA può portare a una migliore comprensione dell’eziologia delle malattie cardiache congenite (CHD).

Gli attuali approcci per la visualizzazione e l’analisi dello sviluppo PAA includono l’immunofluorescenza delle sezioni tissutali, i calchi vascolare, l’iniezione di inchiostro dell’India, la microscopia episcopica ad alta risoluzione e/o l’immunohistochimica a monte intero1,4,5,6,7. Qui, descriviamo un protocollo che combina l’immunofluorescenza a montaggio intero, la microscopia confocale e il rendering delle immagini 3D al fine di raccogliere, analizzare e quantificare i dati volumetrici, la connettività vascolare e l’identità cellulare. Inoltre, dettagliamo un metodo per compartimentare e quantificare il numero di EC in ogni arco faringeo come mezzo per studiare la formazione del plesso vascolare dell’arco faringeo e il suo rimodellamento nei PAA. Mentre questo protocollo è progettato per l’analisi dello sviluppo PAA, può essere utilizzato per analizzare altre reti vascolari in via di sviluppo.

Protocol

L’uso e le procedure sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Rutgers University. 1. Preparazione delle soluzioni Preparare 1 L di fosfato bufferizzato salina con 0.1% Triton-X-100 (PBST) e sterilizzare il filtro. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente (RT) per almeno un anno. Preparare 600 l di buffer di blocco costituito dal 10% del siero normale dell’asino in PBST. Rendere questa soluzio…

Representative Results

L’intero protocollo di immunofluorescenza montato qui produce risultati chiari e puliti, consentendo la ricostruzione 3D dell’endotelio dell’arco fariano, come si vede nella Figura 1A. È importante incubare gli embrioni per una quantità sufficiente di tempo in ogni soluzione anticorpale per garantire una completa penetrazione attraverso il campione, nonché lavare accuratamente gli embrioni dopo l’incubazione dell’anticorpo. Nella <strong c…

Discussion

La capacità di visualizzare l’endotelio negli embrioni di topo in 3D ha fornito nuove intuizioni sul loro sviluppo3. Qui presentiamo un protocollo che consente l’imaging 3D ad alta risoluzione degli embrioni, la visualizzazione della connettività vascolare e analisi quantitative della formazione di PAA. Questo protocollo può essere impiegato per vedere come le alterazioni genetiche o gli insulti ambientali influiscono sullo sviluppo PAA. La procedura qui riportata utilizza anticorpi contro VEGF…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Brianna Alexander, Caolan O’Donnell e Michael Warkala per un’attenta lettura e modifica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti del National Heart, Lung and Blood Institute del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR è supportato da NHLBI HL103920-08S1 e dall’Istituto Nazionale di Artrite e Musculoscheletrie e Malattie della Pelle Sovvenzionia T32052283-11.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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