Summary

Creazione in Situ Circuito Chiuso Perfusione di Organi Addominali Inferiori e Arti Hind in Topi

Published: August 13, 2020
doi:

Summary

Un protocollo è descritto per la perfusione in situ del corpo inferiore del topo, tra cui la vescica, la prostata, gli organi sessuali, l’osso, il muscolo e la pelle del piede.

Abstract

La perfusione ex vivo è un importante strumento fisiologico per studiare la funzione degli organi isolati (ad es. fegato, reni). Allo stesso tempo, a causa delle piccole dimensioni degli organi di topo, la perfusione ex vivo di ossa, vescica, pelle, prostata e organi riproduttivi è impegnativa o non fattibile. Qui, riportiamo per la prima volta un circuito di perfusione in situ inferiore del corpo nei topi che include i tessuti di cui sopra, ma bypassa i principali organi di clearance (rene, fegato e milza). Il circuito è stabilito cannulando l’aorta addominale e vena cava inferiore sopra l’arteria iliac e la vena e cauterizzare i vasi sanguigni periferici. La perfusione viene eseguita tramite una pompa peritale con flusso di perfnone mantenuto fino a 2 h. La colorazione in situ con lectina fluorescente e la soluzione Hoechst hanno confermato che la microvaslatura è stata perfusa con successo. Questo modello murino può essere uno strumento molto utile per studiare i processi patologici, nonché i meccanismi di somministrazione di farmaci, la migrazione/metastasi delle cellule tumorali circolanti in/dal tumore e le interazioni del sistema immunitario con organi e tessuti perfusi.

Introduction

La perfusione di organi isolati è stata originariamente sviluppata per studiare la fisiologia degli organi per il trapianto1,2,3e ha permesso di comprendere le funzioni degli organi senza interferenze da altri sistemi corporei. Ad esempio, la perfusione isolata di reni e cardiaci è stata immensamente utile per comprendere i principi di base dell’emodinamica e degli effetti degli agenti vasoattivi, mentre la perfusione epatica era importante per comprendere la funzione metabolica, compreso il metabolismo dei farmaci nel tessuto sano e malato4,5,6,7. Inoltre, gli studi di perfusione sono stati fondamentali per comprendere la vitalità e la funzione degli organi destinati al trapianto. In Cancer Researchearch, la perfusione tumorale isolata è stata descritta da diversi gruppi utilizzando topo, ratto e tessuti umani appena resezionati8,9. In qualche perfusione tumorale isolato, il tumore è stato impiantato nel tampone di grasso ovarico per forzare la crescita del tumore che fornisce vasi sanguigni dall’arteria mesenteria10. Il gruppo giainista ha eseguito studi pionieristici utilizzando perfusione isolata di adenocarcinomi del colon per comprendere l’emodinamica tumorale8,11,12,13. Altre innovative configurazioni ex vivo ingegnerizzate includono un dispositivo di perfusione a base di piastra 96 per colture le cellule primarie del mieloma multiplo umano14 e una camera di flusso modulare per l’architettura del midollo osseo e la ricerca sulle funzioni15.

Oltre agli studi di fisiologia e patologia, la perfusione di organi è stata utilizzata per studiare i principi di base della somministrazione di farmaci. Così, un gruppo ha descritto la perfusione isolata degli arti di ratto e ha studiato l’accumulo di liposomi nei sarcomi impiantati16, mentre un altro gruppo ha eseguito la perfusione renale umana per studiare il targeting endoteliale delle nanoparticelle17. Ternullo et al. utilizzato un lembo della pelle umana perfuso isolato come un modello di penetrazione dei farmaci per la pelle vicino a in vivo18.

Nonostante questi progressi nella perfusione di grandi organi e tessuti, non ci sono state segnalazioni su modelli di perfusione in situ nei topi che: a) bypassare organi di gioco come fegato, milza e reni; b) includere organi pelvici, pelle, muscoli, organi riproduttivi (nel maschio), vescica, prostata e midollo osseo. A causa delle piccole dimensioni di questi organi e della vascolatura di fornitura, la cannulazione ex vivo e la creazione di un circuito di perfusione non è stato fattibile. Il topo è il modello animale più importante nella ricerca sul cancro e sull’immunologia e nella somministrazione di farmaci. La capacità di perfusire piccoli organi di topi consentirebbe di rispondere a interessanti domande riguardanti la somministrazione di farmaci a questi organi, compresi i tumori impiantati nel bacino (vescica, prostata, ovaia, midollo osseo), nonché studi sulla fisiologia di base e l’immunologia delle malattie di questi organi. Per affrontare questa carenza, abbiamo sviluppato un circuito di perfusione in situ nei topi che può potenzialmente evitare lesioni tissutali ed è molto più adatto per la ricerca funzionale rispetto alla perfusione di organi isolati.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università del Colorado. 1. Preriscaldare il sistema di perfusione Preparare il sistema di perfusione prima dell’intervento chirurgico avviando un bagno d’acqua circolante di 37 gradi centigradi per tutti i componenti con rivestimenti ad acqua (serbatoio perfusati, camera umida e coperchio) come mostrato in una configurazione personalizzata nella Figura…

Representative Results

Abbiamo creato un sistema di perfusione a circuito chiuso attraverso la canonazione dell’aorta addominale e la vena cava inferiore di 8-10 settimane di topi anziani, mantenendo il volume di buffer perfusione inferiore a 10 mL. La figura 3A mostra le immagini confocali dopo aver perfuso i tessuti con la soluzione di Ringer contenente Hoechst 33342 e DyLight 649-lectin. Muscolo, midollo osseo, testicoli, vescica, prostata, e la pelle del piede mostrano efficiente colorazione nucleare e vascola…

Discussion

Il circuito descritto può essere utilizzato per sondare varie domande di ricerca, ad esempio il ruolo di diversi componenti del siero e barriere tissutali nella somministrazione di farmaci o nel traffico di cellule immunitarie e staminali. Diversi sistemi di somministrazione di farmaci (ad esempio, liposomi e nanoparticelle) possono essere aggiunti al perfusate per comprendere il ruolo dei fattori fisiologici e biochimici nella consegna. La durata della perfusione può variare, a seconda del tessuto studiato, degli obie…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH CA194058 a DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant n. 31771093), il Progetto di Collaborazione Internazionale della Provincia di Jilin (No.201180414085GH), i Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali, il Programma per JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).

Materials

Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light Amscope SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP Airgas healthcare 19087-5283
Confocal microscope NIKON ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp FIAB F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) Harvard Apparatus 733692 Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) Harvard Apparatus 733524 keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger Harvard Apparatus 732901 Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters Fine Science Tools (FST) 125014
Oxygen compressed, USP Airgas healthcare C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1) Harvard Apparatus 730113 deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) Harvard Apparatus 732806 control the purfusion speed
Silicone pad Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1) Harvard Apparatus (TYGON) 733456
Student standard pattern forceps Fine Science Tools (FST) 91100-12
Surgical Scissors Fine Science Tools (FST) 14001-14
Table for moist chamber Harvard Apparatus 734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1) Harvard Apparatus 724927 circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) Cole-Palmer 30600-02
Veterinary anesthesia machine Highland HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle BD 305186 For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures Keebomed-Hopemedical 427411
6-0 silk sutures Keebomed-Hopemedical 427401
Filter (0.2 µm) ThermoFisher 42225-CA Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker Staedtler 342-9
Syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-823-2E
Syringe (60 mL) BD 309653 Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) Sigma 314-13-6
10% buffered formalin velleyvet 36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution EMRN Medical Supplies Inc. JB2324
Bovine serum albumin Thermo Fisher 11021-037
Cyanoacrylate glue Krazy Glue
DyLight-649-lectin Vector Laboratories,Inc. ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol)) Pharmco 111000190
Hoechst33342 Life Technologies H3570
Isoflurane Piramal Enterprises Limited 66794-017-25
Phosphate buffered saline Gibco 10010023

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Ren, P., Yang, C., Lofchy, L. A., Wang, G., Chen, F., Simberg, D. Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice. J. Vis. Exp. (162), e60847, doi:10.3791/60847 (2020).

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