Summary

Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Published: March 10, 2020
doi:

Summary

In questo protocollo, descriviamo le procedure per analizzare qualitativamente e quantitativamente i fenotipi dello sviluppo nei topi associati a difetti cardiaci congeniti.

Abstract

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell’uomo, che colpisce fino all’1% di tutte le nascite vive. Tuttavia, le cause alla base della CHD sono ancora poco conosciute. Il topo in via di sviluppo costituisce un modello prezioso per lo studio della CHD, perché i programmi di sviluppo cardiaco tra topi e esseri umani sono altamente conservati. Il protocollo descrive in dettaglio come produrre embrioni di topo dello stadio gestazionale desiderato, metodi per isolare e preservare il cuore per l’elaborazione a valle, metodi quantitativi per identificare i tipi comuni di CHD mediante istologia (ad esempio, setto ventricolare difetti, difetti del setto atriale, dotto brevettato arteriosus) e metodi di storitomorfometria quantitativa per misurare i fenotipi comuni della compattazione muscolare. Questi metodi articolano tutti i passaggi coinvolti nella preparazione, raccolta e analisi dei campioni, consentendo agli scienziati di misurare correttamente e riproducibilmente la CHD.

Introduction

Le CHD sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell’uomo e sono la principale causa di decessi correlati ai difetti alla nascita1,2,3,4,5,6. Anche se circa il 90% dei neonati sopravvive alla CHD, è spesso associata a una significativa morbilità e interventi medici nel corso degli anni, imponendo un pesante onere alla vita dei pazienti e al sistema sanitario7,8,9,10. Al di fuori di fattori puramente genetici, le cause della CHD sono poco comprese4. Le cause non identificate rappresentano il 56-66% di tutti i casi di CHD secondo l’American Heart Association e altre fonti2,3,4,11. I fattori ben noti includono mutazioni genetiche, CNV, varianti a singolo nucleotide de novo e aneuploidia. Si sospetta che anche i fattori ambientali e dietetici siano fonti importanti che contribuiscono alla CHD, come suggerito da studi epidemiologici che collegano lo stile di vita materno2,12, privazione economica e razza13,e dalla ricerca su fattori come l’acido folico11,14 e l’acido retinoico lipidico bioattivo15,16. Lo studio dei meccanismi e delle cause della CHD e di altri difetti cardiovascolari è importante sviluppare strategie preventive e nuove opzioni terapeutiche1,4,17,18,19.

Il topo in via di sviluppo è un modello fondamentale per studiare la CHD nei mammiferi. Tuttavia, alcuni dei metodi e delle analisi impiegati, come le dissezioni che preservano la morfologia del cuore, l’analisi delle fasi di sviluppo e l’identificazione dei difetti associati alla CHD, possono essere scoraggianti per gli scienziati che sono nuovi all’analisi dei cuori murini. L’obiettivo dei metodi descritti in questo protocollo è quello di offrire linee guida qualitative e quantitative per questi processi. Così, in questo protocollo spieghiamo come eseguire accoppiamenti a tempo per produrre embrioni dello stadio gestazionale desiderato, sezionare le femmine incinte per il recupero del cuore intatto (compresi i tessuti associati come il tratto di deflusso), la fissazione del cuore e la preparazione per criostatista, metodi di istologia di base, analisi quantitative dei difetti cardiaci comuni e analisi qualitativa della compattazione del muscolo cardiaco, un fenomeno precursore comune ad alcuni tipi di CHD.

Protocol

Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti citati in questo documento sono stati trattati utilizzando le linee guida per la cura degli animali del Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Accoppiamento a tempo di topi C57BL6/J per la produzione di embrioni Una volta che i topi hanno raggiunto l’età riproduttiva (6-8 settimane), li mettono insieme in formato di allevamento degli harem (cioè due femmine per un maschio). Prepararli per l’al…

Representative Results

L’indice di compattazione muscolare è stato confrontato tra cuori che si sviluppano in due ambienti diversi, un controllo e un gruppo sperimentale. Questi protocolli sono stati utilizzati per analizzare quantitativamente la compattazione del tessuto muscolare, che ha permesso l’analisi statistica. La compattazione muscolare ha dimostrato di essere significativamente ridotta nei cuori sperimentali rispetto agli embrioni che si sono sviluppati in condizioni non sperimentali. <p class="…

Discussion

Questo protocollo esplora le tecniche coinvolte nell’analisi dello sviluppo cardiaco nei cuori embrionali. Alcune limitazioni di questo metodo sono la destrezza fisica richiesta per le tecniche preparatorie, che possono richiedere pratica, e abilità con l’imaging al microscopio. Se le fette ottenute al criostato sono disordinate, la colorazione ematossialina ed eosina non sarà chiara, o se le immagini scattate al microscopio hanno scarsa illuminazione, il metodo utilizzato con ImageJ non funzionerà. Una limitazione de…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’Aguirre Lab è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health sotto il numero di premio K01HL135464 e dall’American Heart Association sotto il premio numero 19IPLOI34660342.

Materials

15 mL Conical Tube(s) Fisher Scientific # 1495970C
C57BL/6J Mice Jackson Labs C57BL/6J – stock 000664
Coplin Staining Jars (x6) VWR Scientific # 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5 VWR Scientific # 48393-241
Cryostat – Leica CM3050S Leica N/A
Dissecting Dish(s) Fisher Scientific # 50930381
Dumont #5 – Fine Forceps (x2) Fine Science Tools # 11254-20
Eosin Y Solution Millipore Sigma # HT110116-500ML
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) Fisher Scientific # BP2818-500
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma # E9884-100G
Eukitt Millipore Sigma # 03989-100ML
Fine Scissors Fine Science Tools # 14060-10
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC Leica N/A
Glycine Millipore Sigma # 410225-250G
Graefe Forceps Fine Science Tools # 11052-10
Graphpad Prism 8 Software Graphpad
ImageJ Software ImageJ
Kimwipes Fisher Scientific # 06666A
Mayer's hematoxylin solution Millipore Sigma # MHS16-500ML
Micropipette tip(s) – p200 Fisher Scientific # 02707448
Microsoft Excel Software Microsoft
OCT Compound VWR Scientific # 102094-106
Olympus CkX53 Microscope Olympus
Paint Brushes (at least 2)
Paraformaldehyde VWR Scientific # 0215014601 Make into 4% solution (dissolved in PBS)
Pasteur pipette(s) Fisher Scientific # 13-711-7M
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific # 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific # 70011044 Dilute from 10x to 1x before using
Scale Mettler Toledo # MS1602TS
Scale Mettler Toledo # MS105
Scalpel Handle #3 VWR Scientific # 10161-918
Scalpel Blades VWR Scientific # 21909-612
Square Mold VWR Scientific # 100500-224 For OCT molds
Sucrose Millipore Sigma # S9378-500G
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific # 1255015
Surgical Scissors Fine Science Tools # 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades VWR Scientific # 25608-964
Travel Scale Acculab VIC 5101
Xylene Millipore Sigma 214736-1L

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Ball, K., Kinne, R., Aguirre, A. Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods. J. Vis. Exp. (157), e60926, doi:10.3791/60926 (2020).

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