Summary

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Published: May 01, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell’mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.

Abstract

L’ibridazione in situ (ISH) è una tecnica molto informativa per presentare modelli di distribuzione cellulare di geni specifici (ad esempio, mRNA e ncRNA) nei tessuti. Il verme sipunculid Sipunculus nudus è una risorsa di pesca cruciale in quanto ha alti valori nutrizionali e medicinali. Attualmente, la ricerca sulla biologia molecolare di Sipunculus nudus è ancora agli inizi. Lo scopo di questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per localizzare mRNA specifico nel liquido coelomico del nucleo sipunculus. Il protocollo include passaggi dettagliati di ISH, tra cui l’antisensesità con etichette di digossigenina e la preparazione del risonante senso, la raccolta e la preparazione della sezione dei fluidi coelomici, l’ibridazione specifica di riboprobe, l’incubazione degli anticorpi, i trattamenti di post-colorazione. Vengono dimostrati i risultati rappresentativi ottenuti da un esperimento riuscito con questo metodo. Il protocollo dovrebbe essere applicabile anche ad altre specie di Sipuncula.

Introduction

ISH, utilizzando una sonda di acido nucleico etichettata per rilevare il DNA specifico o la sequenza di RNA di interesse, è un metodo utile per descrivere il modello di espressione spaziale dei geni bersaglio nei tessuti morfologicamente conservati1,2,3. Normalmente, la sequenza bersaglio viene generata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), e quindi utilizzata come modello per sintetizzare la sonda RNA antisense/sense etichettata con digossigenina uridina-5′-triplodiato. I campioni vengono fissati e permeabilizzati prima dell’incubazione con riboprobe. Dopo aver lavato via la sonda in eccesso, l’ibridazione viene visualizzata dall’immunosofochimica utilizzando un anticorpo anti-digoxygenina, che è alcalino fosforo coniugato3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordine Sipunculida: Sipunculidae) è un verme marino non segmentato, coelomate e bilateralmente simmetrico7,8. Sipunculus nudus è una specie cosmopolita ampiamente distribuita nelle acque costiere tropicali e temperate. È anche un’importante risorsa di pesca marina nel sud della Cina a causa dei suoi alti valori nutrizionali e medicinali9,10. Tuttavia, Sipunculus nudus in biologia molecolare è ancora agli inizi. Per comprendere appieno il ruolo biologico dei geni, lo studio dei modelli di espressione dei geni a una risoluzione cellulare è di grande interesse. Nell’organismo non modello Sipunculus nudus, il metodo ISH, che è un metodo ideale per rilevare i modelli di espressione dei geni, non è ancora stato stabilito. Il suo fluido coelomico contiene diversi tipi di cellule, tra cui granulociti, cellule dell’urna, cellule vescicolari, cellule germinali, eritrociti, ecc11. Il doppio sesso/mab-3 correlato fattore di trascrizione-1 (dmrt1), utilizzato come gene rappresentativo in questo metodo, è un regolatore trascrizionale altamente conservato di determinazione sessuale e differenziazione nella maggior parte delle specie che vanno dagli invertebrati ai mammiferi12,13. In una serie di specie (ad es. porgy nero, ecc.) 14, dmrt1 è stato espresso nelle cellule di Sertoli, che circondano le cellule germinali, la cui funzione è simile alle cellule trofoblaste di Sipunculus nudus. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il dmrt1 di Sipunculus nudus sia espresso in cellule trofoblaste di spermatozeugmata, e il risultato del metodo ISH ha chiaramente confermato l’ipotesi.

Questo protocollo descrive per la prima volta ISH, con sonde antisenso/mRNA antisenso etichettate con digossigenina, per determinare i modelli di espressione dell’mRNA nel suo striscio fluido coelomico. Vengono fornite le condizioni di reazione ottimali, che consentono una visualizzazione molto sensibile dell’espressione dell’mRNA ad alta risoluzione. Il metodo ISH sviluppato potrebbe essere potenzialmente applicato in più specie di Sipunculida diverse da Sipunculus nudus.

Protocol

La procedura animale è stata approvata dal Comitato per la cura e il benessere degli animali dell’Università di Huaqiao. 1. Preparazione Riboprobe Design Primer Aprire il programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiare la sequenza dmrt1 (GenBank: MK182259) nella finestra della sequenza. Impostare la lunghezza del primer (23-25 bp), la temperatura di fusione (55-60 gradi centigradi) e il contenuto di G/C (40-60%). Fare clic su <s…

Representative Results

Una sintesi dei passaggi coinvolti in ISH è illustrata nella Figura 1. Antisense e corrispondenti rionde senso per dmrt1 sono stati sintetizzati da prodotti PCR amplificati dai cDNA fluidico coelomici. L’autenticità dei prodotti PCR è stata verificata mediante sequenziamento diretto. I riboprobe sono stati sintetizzati utilizzando polimerasi T7 RNA secondo i protocolli del produttore e un rapporto precedente4 con alcune modifiche minori. I segnali rapprese…

Discussion

Studi precedenti hanno dimostrato che ish è adatto per rilevare più RNA bersaglio16,17,18. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo ISH ad alta risoluzione per rilevare l’mRNA nel fluido coelomico e sottolineare le condizioni di ibridazione ottimizzate nel sipunculus nudus. I segnali evidenti di dmrt1 che abbiamo osservato hanno dimostrato la riuscita applicazione di questo protocollo nella rilevazio…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Young Scientists Fund della National Natural Science Foundation of China (Grant no.

Materials

Agarose Biowest 111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit Beyotime C3206
Bovine Serum Albumin Sigma B2064
Centrifuge Eppendorf 5415R
Citric acid Sinopharm Chemical Reagent Co. 5949-29-1
Citric acid trisodium Sinopharm Chemical Reagent Co. 4/3/6132
Coverslips Beyotime FCGF60
Deionized formamide Amresco 12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC Sigma D5758 Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix Roche 11277073910
DNase I, RNase-free Invitrogen 18047019
EDTA Sigma 431788
Electrophoresis gel imaging Bio-Rad Universal Hood III
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co. 64-17-5
Gel extraction kits Omega D2500
Gel-electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory DYY-6C
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co. 56-81-5
Glycine Sigma G5417
Heparin Sigma 8/1/9041
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co. 7447-40-7
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7778-77-0
LiCl Sigma 203637
Maleic acid Sinopharm Chemical Reagent Co. 110-16-7
Methanol Sinopharm Chemical Reagent Co. 67-56-1 Noxious substance
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7786-30-3
Na2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7558-79-4
NaCl Biofount JT0001
NaOH Sinopharm Chemical Reagent Co. 1310-73-2 Corrosive
Paraffin film Bemis Company, Inc. PM-996
Paraformaldehyde, PFA Sigma 158127 Noxious substance
PCR Instrument Life Technology Proflex
Pins Deli 16
Pipette Eppendorf plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides Liusheng VER_A01
Proteinase K Sigma SRE0005
RNase free water HyClone SH30538. 02
RNase inhibitor Roche 3335399001
S. nudus
Sheep serum Beyotime C0265
Slide staining jar Beyotime FG010
Slide storage box Beyotime FBX011
Small autoclaved scissors Shuanglu sku_8330
Spectrophotometers Thermo Fisher NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases Roche 10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X) Thermo Scientific K1081
Tris HCl Sigma RES3098T
tRNA Roche 10109517001
Tween-20 Sigma P1379
Water bath Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial HH-S2

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Li, W., Yuan, M., Wu, Y. In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid. J. Vis. Exp. (159), e61022, doi:10.3791/61022 (2020).

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