Summary

In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell’ambiente.

Abstract

I comportamenti microbici, come la motilità e la chemiotaxis (la capacità di una cellula di alterare il suo movimento in risposta a un gradiente chimico), sono diffusi nei domini batterici e archeali. La chemitaxis può comportare notevoli vantaggi di acquisizione delle risorse in ambienti eterogenei. Svolge anche un ruolo cruciale nelle interazioni simbiotiche, nelle malattie e nei processi globali, come il ciclo biogeochimico. Tuttavia, le tecniche attuali limitano la ricerca sulla chemiotaxis al laboratorio e non sono facilmente applicabili sul campo. Presentato qui è un protocollo passo-passo per la distribuzione del saggio in situ chemiotaxis (ISCA), un dispositivo che consente un robusto interrogatorio di chemiotaxis microbica direttamente nell’ambiente naturale. L’ISCA è un dispositivo microfluidico costituito da un array di 20 possilui, in cui possono essere caricate sostanze chimiche di interesse. Una volta impiegate in ambienti aque, le sostanze chimiche si diffondono fuori dai pozzi, creando gradienti di concentrazione che i microbi percepiscono e rispondono nuotando nei pozzi tramite chemiotaxis. Il contenuto dei beni può quindi essere campionato e utilizzato per (1) quantificare la forza delle risposte chemiotatiche a composti specifici attraverso la citometria del flusso, (2) i microrganismi reattivi isolati e della coltura e (3) caratterizzare l’identità e il potenziale genomico delle popolazioni che rispondono attraverso tecniche molecolari. L’ISCA è una piattaforma flessibile che può essere impiegata in qualsiasi sistema con una fase molto aque, compresi gli ambienti marini, d’acqua dolce e del suolo.

Introduction

Diversi microrganismi utilizzano motilità e chemiotaxis per sfruttare ambienti nutritivi patchy, trovare ospiti, o evitare condizioni deleteri1,2,3. Questi comportamenti microbici possono a loro volta influenzare i tassi di trasformazione chimica4 e promuovere partenariati simbiotici tra gli ecosistemi terrestri, d’acqua dolce e marini2,5.

La chemitaxis è stata ampiamente studiata in condizioni di laboratorio negli ultimi 60 anni6. Il primo metodo quantitativo per studiare la chemitaxis, il saggio capillare, prevede un tubo capillare riempito con un chemoattractant putativo immerso in una sospensione del batterio6. La diffusione della sostanza chimica fuori dal tubo crea un gradiente chimico, e i batteri chemiotatici rispondono a questo gradiente migrando nel tubo7. Dallo sviluppo del saggio capillare, ancora oggi ampiamente utilizzato, molte altre tecniche sono state sviluppate per studiare la chemiotassi in condizioni fisiche/chimiche sempre più controllate, con la più recente che prevede l’uso di microfluidics8,9,10.

La microfluidica, insieme alla microscopia video ad alta velocità, consente di monitorare il comportamento delle singole cellule in risposta a gradienti attentamente controllati. Anche se queste tecniche hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della chemiotaxis, sono state limitate all’uso di laboratorio e non si traducono facilmente nella distribuzione sul campo nei sistemi ambientali. Di conseguenza, la capacità delle comunità naturali di batteri di utilizzare la chemitaxis all’interno degli ecosistemi naturali non è stata esaminata; pertanto, l’attuale comprensione della potenziale importanza ecologica della chemiotassi è prevenita verso le condizioni di laboratorio artificiali e un numero limitato di isolati batterici in laboratorio. L’ISCA recentemente sviluppato supera queste limitazioni11.

L’ISCA si basa sul principio generale del saggio capillare; tuttavia, si fa uso di moderne tecniche di microfabbricazione per fornire una piattaforma sperimentale altamente replicata e facilmente distribuibile per la quantificazione della chemiotassi verso composti di interesse nell’ambiente naturale. Permette anche l’identificazione e la caratterizzazione dei microrganismi chemiotattici mediante isolamento diretto o tecniche molecolari. Mentre il primo dispositivo di lavoro è stato auto-fabbricato e costruito in vetro e PDMS11, l’ultima versione a iniezione è composta da policarbonato, utilizzando una procedura di fabbricazione altamente standardizzata (per interesse per l’ultima versione del dispositivo, gli autori corrispondenti possono essere contattati).

L’ISCA è di dimensioni di carta di credito ed è costituito da 20 pozzi distribuiti in un array di pozzi 5 x 4, ciascuno collegato all’ambiente acquatico esterno da una piccola porta (800 m di diametro; figura 1). Chemoattractants putativi caricati nei pozzi si diffondono nell’ambiente attraverso il porto, e i microbi chemiotattici rispondono nuotando attraverso il porto nel pozzo. Poiché molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento ISCA nell’ambiente naturale, questo protocollo passo-passo aiuterà i nuovi utenti a superare potenziali ostacoli e a facilitare distribuzioni efficaci.

Protocol

Si consiglia di eseguire la sezione 1 prima degli esperimenti sul campo per ottimizzare i risultati. 1. Ottimizzazione di laboratorio NOTA: i volumi descritti nella procedura di ottimizzazione sono sufficienti per un singolo ISCA (composto da 20 pozzetti). Preparazione della sostanza chimica di interesseNOTA: La concentrazione ottimale per ogni chemioattractant spesso deve essere determinata in condizioni di laboratorio prima delle distribuzioni sul ca…

Representative Results

Questa sezione presenta i risultati di laboratorio utilizzando l’ISCA per testare la risposta chemiotattica dei microbi marini a una gamma di concentrazione di glutammina, un aminoacido noto per attirare i batteridel suolo 14. La concentrazione di glutammina che ha suscitato la risposta chemiotatica più forte nei test di laboratorio è stata utilizzata per eseguire un saggio di chemiotaxis nell’ambiente marino. Per eseguire i test di laboratorio, le comunità di acqua …

Discussion

Alla scala dei microrganismi acquatici, l’ambiente è tutt’altro che omogeneo ed è spesso caratterizzato da gradienti fisici/chimici che strutturano le comunità microbiche1,15. La capacità dei microrganismi motile di utilizzare il comportamento (cioè la chemiotaxis) facilita il foraggiamento all’interno di questi microambimi eterogenei1. Lo studio della chemitaxis direttamente nell’ambiente ha il potenziale per identificare importanti …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, attraverso la sovvenzione GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e un Investigator Award (GBMF3783) a R.S., così come una borsa di studio dell’Australian Research Council (DE160100636) a J.B.R., un premio della Simons Foundation a B.S.L. (5941111), e una sovvenzione dalla Simons Foundation (542395) a R.S. come parte dei Principi di Ecosistema Microbiale (PriME) PriME.

Materials

Acrylic glue Evonik 1133 Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet McMaster-Carr 8505K725 Or different company
Adhesive tape Scotch 3M 810 Scotch Magic tape
Autoclave Systec D-200 Or different company
Benchtop centrifuge Fisher Scientific 75002451 Or different company
Bungee cord Paracord Planet 667569184000 Or different company
Centrifuge tube – 2 mL Sigma Aldrich BR780546-500EA Eppendorf tube
Conical centrifuge tube – 15 mL Fisher Scientific 11507411 Falcon tube
Conical centrifuge tube – 50 mL Fisher Scientific 10788561 Falcon tube
Deployment arm Irwin 1964719 Or different company
Deployment enclosure plug Fisher Scientific 21-236-4 See alternatives in manuscript
Disposable wipers Kimtech – Fisher Scientific 06-666 Kimwipes
Flow cytometer Beckman C09756 CYTOFlex
Glutaraldehyde 25% Sigma Aldrich G5882 Or different company
Green fluorescent dye Sigma Aldrich S9430 SYBR Green I – 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm Merck C3235 Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) Contact corresponding authors
Laser cutter Epilog Laser Fusion pro 32 Or different company
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Or different company
Marine Broth 2216 VWR 90004-006 Difco
Nylon slotted flat head screws McMaster-Carr 92929A243 M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set Fisher Scientific 05-403-151 Or different company
Pipette tips – 1 mL Fisher Scientific 21-236-2A Or different company
Pipette tips – 20 µL Fisher Scientific 21-236-4 Or different company
Pipette tips – 200 µL Fisher Scientific 21-236-1 Or different company
Sea salt Sigma Aldrich S9883 For artificial seawater
Serological pipette – 50 mL Sigma Aldrich SIAL1490-100EA Or different company
Syringe filter – 0.02 µm Whatman WHA68091002 Anatop filter
Syringe filter – 0.2 µm Fisher Scientific 10695211 Or different company
Syringe needle 27G Henke Sass Wolf 4710004020 0.4 × 12 mm
Syringes – 1 mL Codau 329650 Insulin Luer U-100
Syringes – 10 mL BD 303134 Or different company
Syringes – 50 mL BD 15899152 Or different company
Tube rack – 15 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Tube rack – 50 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap McMaster-Carr 8305A77 Or different company
Vacuum filter – 0.2 µm Merck SCGPS05RE Steritop filter

Riferimenti

  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
  2. Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
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  4. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
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Citazione di questo articolo
Clerc, E. E., Raina, J., Lambert, B. S., Seymour, J., Stocker, R. In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems. J. Vis. Exp. (159), e61062, doi:10.3791/61062 (2020).

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