Summary

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l’interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l’efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

Abstract

f La ricerca antidroga per il trattamento delle infezioni polmonari sta progredendo verso modelli in vitro predittivi di elevata complessità. La presenza multiforme di batteri nei modelli polmonari può riapproizionare la disposizione epiteliale, mentre le cellule immunitarie coordinano una risposta infiammatoria contro i batteri nel microambiente. Mentre i modelli in vivo sono stati la scelta per testare nuovi anti-infettivi nel contesto della fibrosi cistica, non imitano ancora con precisione le condizioni in vivo di tali malattie negli esseri umani e gli esiti del trattamento. Modelli complessi in vitro delle vie aeree infette basate su cellule umane (epiteliali bronchiali e macrofagi) e agenti patogeni rilevanti potrebbero colmare questa lacuna e facilitare la traduzione di nuovi anti-infettivi nella clinica. Per tali scopi, è stato stabilito un modello di co-coltura della linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o– e dei macrofagi derivati dai monociti THP-1, che imitano un’infezione della mucosa bronchiale umana da P. aeruginosa in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questo modello è impostato in sette giorni, e i seguenti parametri sono valutati contemporaneamente: integrità barriera epiteliale, trasmigrazione macrofagi, sopravvivenza batterica, e infiammazione. Il presente protocollo descrive un sistema robusto e riproducibile per valutare l’efficacia dei farmaci e le risposte dell’ospite che potrebbe essere rilevante per scoprire nuovi anti-infettivi e ottimizzare la loro consegna di aerosol ai polmoni.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno rilevante nella fibrosi cistica (CF) che contribuisce al danno del tessutopolmonare 1. La produzione di polisaccharides, come l’alginato e altri esopolidi mucoidi, coordina il progresso della malattia, che porta ad una tenace aderenza batterica, limita la somministrazione di antibiotici ai batteri e protegge i batteri contro il sistema immunitario dell’ospite2. La transizione di P. aeruginosa dallo stadio planctonic alla formazione di biofilm è una questione critica in questo contesto, facilitando anche l’insorgenza della tolleranza antibiotica.

Nel contesto di CF, il mouse è stato utilizzato principalmente come modello. I topi, tuttavia, non sviluppano spontaneamente questa malattia con l’introduzione di mutazioni CF3. La maggior parte dello sviluppo di biofilm batterici e studi di suscettibilità ai farmaci sono stati eseguiti su superfici abiotiche, come i piatti Petri. Tuttavia, questo approccio non rappresenta la complessità in vivo. Ad esempio, sono assenti importanti barriere biologiche, comprese le cellule immunitarie e l’epitelio mucoso. Anche se P. aeruginosa è abbastanza tossico per le cellule epiteliali, alcuni gruppi sono riusciti a co-coltivare un precedente biofilm P. aeruginosa con cellule bronchiali umane. Queste cellule hanno avuto origine da pazienti affetti da fibrosi cistica con mutazione CFTR (CFBE41o cellule)4 e hanno permesso di valutare l’efficacia antibiotica5 o valutare la correzione della proteina CFTR durante l’infezione6. Tale modello è stato indicato per migliorare la prevedibilità dell’efficacia dei farmaci, oltre a consentire la caratterizzazione dei problemi con i farmaci che non sono riusciti nelle fasi successive dello sviluppo di farmaci7.

Tuttavia, nel polmone, l’epitelio mucoso è esposto all’aria. Inoltre, le cellule immunitarie presenti nelle vie aeree, come i macrofagi tissed, svolgono un ruolo essenziale contro gli agenti patogeni inalati o le particelle8. I macrofagi migrano attraverso i diversi strati cellulari per raggiungere il lume bronchiale e combattere l’infezione. Inoltre, i farmaci inalati devono anche far fronte alla presenza di muco come elemento aggiuntivo non cellulare della barriera polmonare aria-sangue9. Infatti, sono stati sviluppati diversi modelli complessi tridimensionali (3D) in vitro, con l’obiettivo di aumentare la rilevanza in vivo. I sistemi di co-coltura non solo aumentano la complessità dei sistemi in vitro per la scoperta di farmaci, ma consentono anche di studiare le interazioni tra cellule cellulari. Tale complessità è stata affrontata negli studi sulla migrazione dei macrofago10, il rilascio di peptidi antimicrobici da parte dei neutrofili11, il ruolo del muconell’infezione 9e la reazione cellulare epiteliale a dannieccessivi 12. Tuttavia, un modello in vitro affidabile infettato da CF che presenta la mutazione genetica in CF, che è esposto all’aria (maggiore condizione fisiologica), e integra le cellule immunitarie è ancora carente.

Per colmare questa lacuna, descriviamo un protocollo per la co-coltura 3D umana stabile delle vie aeree infette. Il modello è costituito da cellule epiteliali e macrofagi bronchiali CF umani, infettati da P. aeruginosa e in grado di rappresentare sia una barriera diffusionale che immunologica. Con l’obiettivo di testare gli anti-infettivi a un rendimento ragionevolmente elevato, questa co-coltura è stata stabilita sulla membrana filtro permeabile di inserti a piastre ben, utilizzando due linee cellulari umane: CFBE41o– e macrofagi derivati da monociti THP-1. Inoltre, per studiare alla fine la deposizione di anti-infettivi aerosolizzati13, il modello è stato stabilito all’interfaccia aria-liquido (ALI) piuttosto che alle condizioni di trattamento con liquido (LCC).

Come riferiamo qui, questo modello permette di valutare non solo la sopravvivenza batterica su un trattamento antibiotico, ma anche la citotossicità cellulare, l’integrità della barriera epiteliale, la trasmigrazione dei macrophage e le risposte infiammatorie, che sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.

Questo protocollo combina due tipi di cellule rilevanti per la terapia dell’inalazione delle vie aeree polmonari: i macrofagi e l’epitelio bronchiale CF. Queste cellule sono semi su lati opposti di inserti di supporto permeabili, permettendo l’esposizione delle cellule all’aria (chiamata condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questa co-coltura delle cellule ospitante viene successivamente infettata da P. aeruginosa. Entrambe le linee cellulari ospitali sono di origine umana: le cellule epiteliali rappresentano l’epitelio bronchiale della fibrosi cistica, con una mutazione sul canale CF (CFBE41o), e le cellule THP-114 sono una linea cellulare macrofamiga ben caratterizzata. Uno strato epiteliale confluente è prima permesso di formarsi sul lato superiore degli inserti di piastra del pozzo prima che le cellule macrofagi vengono aggiunte al vano opposto. Una volta stabilita la co-cultura in ALI, il sistema viene inoculato con P. aeruginosa sul lato apical. Questo sistema di co-coltura infetto viene quindi utilizzato per valutare l’efficacia di un antibiotico, ad esempio tobramicina. Vengono analizzati i seguenti punti finali: integrità della barriera epiteliale in termini di resistenza elettrica transepithelial (TEER), visualizzazione delle interazioni cellula-cellula-cellula-batterio mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), sopravvivenza batterica mediante conteggio di unità formanti di colonia (CFU), sopravvivenza delle cellule ospite (citotossicità) e rilascio di citochine.

Protocol

1. Crescita e differenziazione delle cellule negli inserti di supporto permeabili Coltivare CFBE41o- in una fiaschetta T75 con 13 mL di mezzo minimo essenziale (MEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS), 1% di amminoacidi non essenziali e glucosio 600 mg/L a 37 gradi centigradi con 5 % di atmosfera di CO2. Aggiungere mezzo fresco alle cellule ogni 2-3 giorni. Staccare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza nel pallone con 3 mL di trypsin- acido etilenedia…

Representative Results

La figura 1A mostra la morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi dopo essere cresciuta sia per 24 h sul lato apicale che basolaterale dei supporti permeabili, rispettivamente. L’integrità della barriera epiteliale è dimostrata da TEER più alto (834 Ω-cm2) e CLSM da immunostaining per la proteina di giunzione stretta O-1 (Figura 1B). Gli stessi risultati osservati in termini di integrità barri…

Discussion

Questo documento descrive un protocollo per una co-coltura 3D delle vie aeree infette, costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dalla linea cellulare macrofamizza derivata dal monocito umano THP-1. Il protocollo consente la valutazione dell’integrità della barriera epiteliale, della trasmigrazione dei macrofagio, della sopravvivenza dei batteri e dell’infiammazione, che sono parametri importanti quando si testano l’efficacia dei farmaci e le risposte dell’ospite contemporanea…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal programma HORI-2020 dell’Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – Progettazione e sviluppo di nanomedicine avanzate per superare le barriere biologiche e per il trattamento di gravi malattie. Ringraziamo la Dott.ssa Ana Costa e la Dott.ssa Jenny Juntke per il grande sostegno allo sviluppo della co-cultura, Olga Hartwig, per l’illustrazione scientifica, Anja Honecker, per i saggi ELISA, Petra Kànig, Jana Westhues e la dott.ssa Chiara De Rossi per il supporto alla cultura cellulare, all’analisi e alla microscopia. Ringraziamo anche Chelsea Thorn per aver letto il nostro manoscritto.

Materials

Accutase Accutase AT104
Ampicillin Carl Roth, Germany HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer OLS Omni Life Sciences
CellTrace Far Red Thermo Fischer C34564
Centrifuge Universal 320R Hettich, Germany 1406
CFBE41o cells 1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm World Precision Instruments, Sarasota, USA STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM Leica, Mannheim, Germany TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits Affymetrix eBioscience, USA 15541037
Cytokines Panel I and II LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). 740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche 11644793001
D-(+) Glucose Merck 47829
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fischer D1306
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments, Sarasota, USA EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile Corning, Amsterdam, Netherlands 353181
Fetal calf serum Lonza, Basel, Switzerland DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Invitrogen A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle Roche, Mannheim, Germany 10127230001
LB broth Sigma-Aldrich, Germany L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11140050
P. aeruginosa strain PAO1 American Type Culture Collection 47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP American Type Culture Collection 10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% EMS DIASUM 15710-S
Phosphate buffer solution buffer Thermo Fischer 10010023
Petri dishes Greiner 664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, Germany P8139-1MG
Precision Cover Glasses ThorLabs CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody BD Transduction Laboratories 610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK 11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) Normax, Portugal 5058561
Saponin Sigma-Aldrich, Germany S4521
T75 culture flasks Thermo Fischer 156499
THP-1 cells Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt Sigma T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fischer 25300054
Tween80 Sigma-Aldrich, Germany P1754

Riferimenti

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution – A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis – where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O’Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

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Citazione di questo articolo
Montefusco-Pereira, C. V., Horstmann, J. C., Ebensen, T., Beisswenger, C., Bals, R., Guzmán, C. A., Schneider-Daum, N., Carvalho-Wodarz, C. d. S., Lehr, C. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp. (160), e61069, doi:10.3791/61069 (2020).

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