Instillazione intratracheale delle cellule staminali nei " ratti neooatali

L'ossigeno supplementare è spesso necessario per trattare i neonati con difficoltà respiratorie¹. Tuttavia, la terapia iperossia nei neonati ha effetti negativi a lungo termine. L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD)². La BPD è una delle principali complicanze del trattamento con iperossia che può verificarsi nonostante la terapia precoce, le procedure di ventilazione ottimali e l'aumento dell'uso della ventilazione a pressione positiva non invasiva nei neonati prematuri. Mentre molte strategie di trattamento sono state segnalate per BPD³, nessuna terapia nota può ridurre questa complicazione.

L'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenire la BPD, perché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella sua patogenesi. Tuttavia, la terapia sistemica corticosteroide non è solitamente raccomandata per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine^4,5.

Le cellule stromali mesenchymal (MSC) hanno caratteristiche pluripotenti e possono differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui osso, cartilagine, tessuto adiposo, muscolo e tendini⁶. Le MSC hanno effetti immunomodulatori, antinfiammatori e rigenerativi⁷, e gli studi sugli animali mostrano i benefici terapeutici delle MSC e dei loro componenti secreti in lesioni polmonari indotte da iperossia nei roditori^8,9. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e la terapia combinata di surfactant e corticosteroidi potrebbero essere una potenziale strategia di trattamento per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Studi preclinici hanno utilizzato la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e del virus adeno-associato nei ratti neonati^10,11,12. Tuttavia, non è disponibile una presentazione passo-passo della tecnica e il monitoraggio in vivo delle cellule staminali trapiantate. Il ratto appena nato è adatto per studiare gli effetti della somministrazione intratracheale sui neonati con difficoltà respiratorie perché lo stadio saccolare del polmone del ratto alla nascita è equivalente a quello del polmone umano a 26-28 settimane di gestazione¹³. Un metodo efficace per la somministrazione nella trachea del ratto è fondamentale per una distribuzione polmonare di successo. La tecnica qui presentata consente lo studio della somministrazione intratracheale di cellule e/o farmaci per il trattamento di malattie polmonari neomotorie utilizzando ratti come modello per gli esseri umani.

Questa procedura è stata approvata dal comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Taipei.

NOTA: le MSC umane sono state equamente trascate da proteine fluorescenti verdi (GFP) e geni di luciferasi delle lucciole (Fluc) ottenuti da un'azienda commerciale (Tabella dei materiali).

1. Caratterizzazione di MSC umani con luciferasi della lucciola e proteina fluorescente verde

1. Mantenere le MSC umane trascate con GFP e Fluc in supporti completi (modifica minima essenziale dell'aquila-alfa media-alfa,, completata con 10-15% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamine, 1 ng/mL base FGF e PSF) a 37 gradi centigradi con umidità satura e 5% di CO₂. Passare le celle a confluenza di 70-90 %.
2. Osservare le MSC in un microscopio a contrasto di fase di fluorescenza (Figura 1A) e analizzare i livelli di espressione di Fluc e GFP¹⁴.
3. Caratterizzare gli MSC analizzando l'espressione dei marcatori CD, tra cui CD44, CD73, CD90, CD105 utilizzando la citometria di flusso (Figura 1B). Indurre la differenziazione della trilina delle cellule staminali a adipociti, condrociti e osteociti, e confermare la differenziazione del trilineage (Figura 1C) di von Kossa, oltra tolmo rosso o Alcian colorazione a seguito di un protocollo commerciale^15,16.

2. Anestesizzazione dei cuccioli di ratto

1. Consentire ai ratti Sprague-Dawley incinte datati nel tempo di consegnare vaginalmente a termine.
2. Togliere i cuccioli di topo dalla gabbia il giorno postnatale 5.
3. Anestesizzare i cuccioli di ratto utilizzando l'anestesia del gas (cioè il 2% di isoflurane) in una camera di anestesia.
4. Confermare l'anestesia adeguata controllando la respirazione e i riflessi.
   NOTA: La respirazione dovrebbe diventare superficiale e i riflessi dovrebbero diminuire. I cuccioli di ratto rimangono incoscienti per almeno 10 dollari con questa concentrazione di isoflurane.

3. Instillazione intratracheale

1. Una volta anestesizzati, trattenete i cuccioli di ratto su un supporto di intubazione inclinati a 60 gradi e tenete i cuccioli in posizione con del nastro di etichettatura di laboratorio su tutti e quattro gli arti.
2. Applicare il nastro sotto il naso per fissare la testa e individuare il collo per la tracheotomia di foratura.
3. Disinfettare l'area di incisione (cioè il collo) con un cuscinetto di preparazione alcolica del 75%.
4. Fare un'incisione collo verticale di 0,3 cm sopra la trachea con microscissors per evitare di danneggiare le arterie carotidee.
5. Dissezionare gli strati di grasso e muscoli per individuare la trachea con una pinzetta affitta a punta curva senza gancio.
6. Tenere la trachea con le pinzette affido punta curva.
7. Tenere una siringa di 100 l e iniettare lentamente 30 l di normale salina (cioè, controllo) o 30 L di MSC fluc-GFP etichettati (1 x 10⁵ celle) nella trachea attraverso una siringa ad ago da 30 G durante la fase di inspir.
8. Chiudere l'incisione con un punto di seta 6-0, legare il nodo il più piccolo possibile e tagliare le estremità il più corto possibile.
9. Posizionare i ratti sotto la luce infrarossa o su una piastra di riscaldamento per tenere al caldo e consentire loro di recuperare dall'anestesia.
10. Verificare che i ratti siano caldi, rosa e in grado di movimento spontaneo prima di restituire i ratti alla gabbia.

4. Monitoraggio della distribuzione polmonare delle MSC

1. Per monitorare le MSC umane trapiantate, iniettare intraperitonenamente i ratti con sale di potassio luciferina in fosfato tamponato salina (PBS) ad una dose di 125 mg/kg di peso corporeo 15 min dopo l'iniezione MSC.
2. Anestesizzare i ratti utilizzando 2% isoflurane attraverso i coni nasali.
3. Acquisire immagini sequenziali a intervalli di 5-15 s 10 min dopo la somministrazione di luciferina con binning medio, 1 f/stop e un campo visivo di 26 cm utilizzando un sistema di imaging di piccoli animali (Tabella dei materiali).
4. Quantificare l'attività di luminescenza dai polmoni in base alle regioni automatiche di interesse utilizzando il software di imaging (Tabella dei materiali)¹⁷.

La distribuzione polmonare dell'instillazione intratracheale delle cellule staminali nei ratti neo-neoanati è stata determinata dalle cellule staminali con etichettatura della lucciola luciferasi (Fluc). Le MSC sono state etichettate con Fluc e etichettate con proteine fluorescenti verdi attraverso la trasduzione lentivirale. La figura 1A mostra un alto livello di espressione GFP nelle MSC umane e il 93,7% della popolazione ha mostrato che l'espressione positiva di GFP rilevata dalla citometria del flusso. Le MSC erano caratterizzate dall'analisi dell'espressione dei marcatori CD (ad esempio CD 44, CD73, CD90 e CD105) e dalla capacità di differenziazione del trilineaggio in osteociti, condrociti e adipociti (Figura 1B,C). Per monitorare i MSC umani trapiantati in vivo, l'imaging della luminescenza dei ratti è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging di piccoli animali. Le misurazioni sono state prese in modo vendicante. I ratti sono stati fissati con nastro adesivo e successivamente è stata somministrata un'iniezione intraperitale di 30 mg/mL di sale di potassio di luciferina in PBS ad una dose di 125 mg/kg di peso corporeo. Luciferasi si combina con luciferina, ossigeno e ATP, e genera luce attraverso una reazione chimica, con conseguente bioluminescenza18. Durante la procedura di imaging, i ratti sono stati anestesi utilizzando 2% isoflurane somministrato attraverso coni nasali. Le immagini di ratto sono state acquisite 10 min dopo l'amministrazione luciferina. Le immagini sequenziali sono state acquisite a intervalli da 5 a 15 s (nessun ritardo di tempo) per almeno 1 min, con binning medio, 1 f/stop e un campo visivo di 26 cm. Utilizzando i dati di misurazione di una sequenza di immagini spettrali filtrate a diverse lunghezze d'onda (560-660 nm), è stata determinata la profondità e la posizione del reporter bioluminescente. I segnali di luminescenza provenienti dai polmoni sono stati calcolati in base alle regioni automatiche di interesse nella modalità di selezione del cerchio. All'intensità media della luminescenza negli animali normali trattati con salina è stato assegnato un valore di uno, e i dati per ogni animale trattato con MSC sono stati normalizzati a quelli degli animali normali trattati con salina.

La figura 2A mostra un'immagine rappresentativa della luminescenza nei polmoni del ratto. Nelle regioni polmonari dei ratti trattati con normale salina non è stata osservata luminescenza. I ratti trattati con MSC mostravano luminescenza nelle regioni della trachea e del polmone centrale. La quantificazione dell'intensità della luminescenza ha rivelato che i ratti trattati con MSC hanno mostrato un aumento di circa 13 volte dell'attività di luminescenza, rispetto ai ratti trattati con la normale salina da soli (Figura 2B).

Figura 1: Caratterizzazione delle MSC umane.
(A) Espressione GFP nelle MSC umane dopo la trasduzione del lentivirus. (B) Espressione dei marcatori CD specifici di MSC (ad esempio, CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Differenziazione trilineare delle MSC umane.

Figura 2: Monitoraggio della distribuzione polmonare della luminescenza mediante un sistema di imaging di piccoli animali.
(A) Un'immagine rappresentativa della distribuzione polmonare delle MSC etichettate nei ratti. Non è stata osservata luminescenza nella regione polmonare dei ratti trattati con normale salina. I ratti trattati con MSC umani mostravano luminescenza nelle regioni tracheali e polmonari. (B) Quantificazione dell'attività di luminescenza nei polmoni del ratto (n . 4). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La scala è foton/s/cm2/sr nell'asse Y. < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.