Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Le infezioni corneali sono importanti cause di cecità e si verificano in proporzioni epidemiche nei paesi a basso e medio reddito. L'eziologia della malattia varia da regione a regione, ma i batteri rappresentano la grande maggioranza di questi casi. Pseudomonas aeruginosa è un importante agente patogeno che causa una malattia rapidamente progressiva. In molti casi, i pazienti sono lasciati con cicatrici stromali, astigmatismo irregolare, richiedono trapianto o, nel peggiore dei casi, perdono un^{occhio 1,2}.

La cheratite batterica causata da P. aeruginosa è un'infezione oculare difficile da trattare, in particolare a causa della crescente comparsa di ceppi antimicrobici resistenti di P. aeruginosa. Nell'ultimo decennio, è diventato evidente che i test e lo sviluppo di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, in generale, e quelli causati da Pseudomonas sp., in particolare, sono essenziali per combattere l'attuale tendenza nella resistenza agli antibiotici³.

Per testare l'efficacia di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, i metodi microbiologici convenzionali in vitro sono un surrogato scadente a causa della differenza nella fisiologia batterica durante la coltura di laboratorio e durante le infezioni in vivo, nonché a causa della mancanza dell'interfaccia ospite^4,5. I modelli animali in vivo, tuttavia, sono costosi e dispendiosi in termini di tempo, possono fornire solo un piccolo numero di repliche e sollevare preoccupazioni sul benessere degli animali.

In questo articolo, dimostriamo un modello di cheratite organotipica ex vivo semplice e riproducibile che può essere utilizzato per testare vari trattamenti per infezioni acute e croniche. Abbiamo usato P. aeruginosa per questo esperimento, ma il modello funziona bene anche con altri batteri e organismi come funghi e lieviti che causano cheratite.

I conigli da laboratorio albini sono stati sacrificati in laboratorio per altri lavori sperimentali pianificati secondo protocolli approvati dall'ufficio domestico. Gli occhi non erano necessari per l'uso sperimentale in quegli studi, quindi sono stati utilizzati per questo protocollo.

1. Sterilizzazione

1. FASE CRITICA: Disinfettare tutte le forcep e le forbici immergendo per 1 h in soluzione 5% (v/v) di Distel in acqua distillata, pulire con una spazzola, risciacquare con acqua del rubinetto e sterilizzare in forno a 185 °C per un minimo di 2 ore.
2. Sterilizzare tutte le altre vetrerie e reagenti in autoclave a 121 °C per 15 minuti o preparare reagenti secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le seguenti procedure in un armadio di sicurezza microbiologica di classe II.

2. Raccolta dei campioni

1. Collezione di occhi suini
   1. Grandi scrofe landrace bianche, fu usata una croce con un cinghiale dell'Hampshire. Gli animali sono rimasti sbalorditi da una corrente elettrica e gli occhi sono stati enucleati 2 ore dopo nel mattatoio.
   2. FASE CRITICA: Una volta enucleata, trasferire gli occhi in laboratorio in una soluzione salina tamponata di fosfato sterile (PBS) per evitare che si asciughino e li elaborino immediatamente all'arrivo.
2. Collezione di occhi di coniglio
   1. Asportare le cornee e inviarle al laboratorio in PBS sterile.

3. Preparazione del pulsante corneosclerale

1. Utilizzare forcelle sterili per tenere il tessuto che circonda il bulbo oculare e trasferirlo in una piastra di Petri. Rimuovere la congiuntiva e il tessuto muscolare attorno al bulbo oculare su una piastra di Petri usando la lama bisturi n. 15 e le fasci.
2. Sollevare delicatamente il bulbo oculare tenendo il nervo ottico con le forcep e trasferirlo in un barattolo da 0,5 L riempito con PBS sterile.
3. Una volta che tutti gli occhi sono stati liberati dal tessuto circostante, spostarli usando forcelle sterili in un altro barattolo da 0,5 L riempito con iodio povidone 3% (v / v) in PBS e lasciare per 1 minuto.
4. Trasferire i bulbi oculari in un altro barattolo da 0,5 L con PBS sterile.
5. Utilizzare le forcep per tenere fermo l'occhio su una piastra di Petri e fare un taglio vicino alla cornea con una lama bisturi n. 10A.
6. FASE CRITICA: Tenere il bordo del taglio e utilizzare le forbici per asportare la cornea lasciando circa 3 mm di sclera che circondano la cornea. Assicurarsi che l'estremità affilata delle forbici non perfori l'iride o il tessuto coroiroidale e si trova nello spazio sopracoroidale.
7. Tenere il pulsante corneosclerale con le forcelle e utilizzare un altro paio di forcelle appuntite per separare delicatamente il tessuto uveale.
8. Sollevare il pulsante corneosclerale dal globo rimanente e sciacquarlo brevemente in una soluzione di iodio povidone 1,5% (v/v) in PBS in una piastra da 12 po po.
9. Posizionare il pulsante corneosclerale in un'altra piastra di 12 pozzi piena di PBS sterile.
10. Dopo aver elaborato tutti gli occhi(consigliato massimo 40 occhi in un lotto),posizionare ogni pulsante corneosclerale su una singola piastra di Petri (34 mm di diametro) lato epiteliale verso l'alto e versare 3 mL di mezzo di coltura pre-riscaldato a 37 °C.
    NOTA: La composizione del mezzo di coltura è la seguente: mezzo dell'aquila modificato (DMEM) di Dulbecco: prosciutto [1:1] integrato con insulina 5 μg-mL^-1 e 10 ng-mL^-1 fattore di crescita epidermico (EGF), 10% (v/v) siero fetale del vitello (FCS), 100 U-mL^-1 penicillina, 100 U-mL^-1 streptomicina e 2,5 μg-mL^-1 ampotericina B. Come passaggio opzionale, il mezzo può essere integrato con 50 g-L^-1 dextran per prevenire il gonfiore della cornea accisa durante le ulteriori fasi di incubazione.
11. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.

4. Mantenimento dei bottoni corneosclerali

1. Dopo 24 ore, utilizzare la tecnica aseptica per rimuovere i mezzi e sostituire con 3 mL di mezzi di coltura freschi pre-riscaldati contenenti antibiotici. Tenere i bottoni corneosclerali nei mezzi con antibiotici per 48 ore per disinfettare le cornee. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.
2. FASE CRITICA: Dopo 48 ore, rimuovere il supporto e risciacquare le cornee con 2 mL di PBS. Quindi tenere i pulsanti corneosclerali in mezzi senza antibiotici per un minimo di due o idealmente tre giorni prima dell'infezione sperimentale, per rimuovere gli antibiotici residui dal tessuto.
3. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato. Cambia i media almeno un'altra volta entro questi tre giorni. Scartare le cornee se si sviluppa una torbidità nel mezzo privo di antibiotici.

5. Preparazione di un inoculo

1. Versare 10 ml di brodo LB in un pallone conico da 50 ml con un tappo di schiuma.
2. Trasferire una colonia di ceppo P. aeruginosa PAO1 o ceppo PA14 da una piastra di agar fresca e incubare a 37 °C per 3-4 ore fino a quando i batteri sono in fase di registro intermedio.
3. Trasferire la coltura di batteri in un tubo da 50 ml e centrifugare a 3.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet di cella in PBS.
4. Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte per lavare le cellule. Sospendere di nuovo il pellet di cellule in PBS e regolare la densità ottica a 600 nm a circa 0,6 utilizzando PBS sterile come vuoto.

6. Infettare il pulsante corneosclerale

1. Rimuovere i supporti dalla piastra di Petri e risciacquare le cornee due volte con 1 mL di PBS sterile.
2. Spremere delicatamente le forcep tenendo la cornea in mezzo. Utilizzare un bisturi 10A per effettuare quattro tagli - due verticali, due orizzontali - nella sezione centrale del pulsante corneosclerale attraverso lo strato epiteliale fino allo stroma sottostante.
3. Posizionare uno stampo di vetro sterile in una piastra di 6 po 'con la parte larga verso l'alto e posizionare la cornea al centro dello stampo di vetro, lato epitelio rivolto verso il basso. Fare il taglio proprio al centro della parte inferiore dello stampo di vetro.
4. FASE CRITICA: Versare 1 mL di 1% (con v) agar a basso punto di fusione sciolto in DMEM per riempire completamente lo stampo di vetro con cornea.
5. Lasciare impostare l'agar e quindi invertire lo stampo di vetro in modo che l'epitelio corneale sia rivolto verso l'alto.
6. Pipetta 15 μL della coltura batterica con OD_600nm = 0,6 (per P. aeruginosa questo equivale a circa 1 x 10^{7 unità} di formazione di colonie (CFU) in 15 μL) direttamente in una zona tagliata e quindi aggiungere 85 μL di PBS alla parte superiore per mantenere umido l'epitelio corneale. Diluire la rimanente coltura batterica e la piastra sull'agar per contare le unità di formazione della colonia per l'inoculo.
7. Aggiungere 1 mL di DMEM senza antibiotici sul fondo di ogni pozzo con lo stampo in vetro. Incubare la piastra a 6 po 'con i bottoni corneosclerali infetti in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO₂ per un massimo di 24 ore.
8. Imposta cornea di controllo non infetta insieme ad ogni esperimento. Per impostare il controllo non infetto, sostituire i 15 μL di coltura batterica nella fase 6.6 con PBS sterile.

7. Omogeneizzazione della cornea per raccogliere i batteri

1. Scartare il mezzo DMEM dal fondo della piastra del pozzo 6 e aggiungere 1 mL di PBS sterile per risciacquare il fondo del pozzo.
2. Rimuovere delicatamente pbs pipettando senza toccare la parte centrale del pulsante corneosclerale. Rimuovere l'anello di vetro utilizzando forcep sterili e posizionarlo nel 5% Distel.
3. Risciacquare delicatamente la parte superiore del pulsante corneosclerale con 1 mL di PBS due volte [facoltativo].
4. Tenere il bordo del pulsante corneosclerale con forceps punta fine e staccarlo dall'agar sottostante.
5. Trasferire la cornea in un tubo da 50 ml riempito con ghiaccio freddo 1-2 mL di PBS.
6. Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per aerare la parte superiore della cornea infetta. Il tessuto non deve essere completamente liquidato. L'omogeneizzatore aiuta a staccare i batteri dall'epitelio corneale e dall'area tagliata.
7. Vortice la cornea in PBS per alcuni secondi per mescolare il contenuto.
8. Aggiungere 20 μL dell'omogeneato a 180 μL di PBS ed eseguire diluizioni seriali in una piastra di pozzo 96.
9. Diluire serialmente la sospensione a^{10-4 e} 10-5 diluizione e pipetta 10 μL dell'omogeneato diluito con batteri su una piastra di agar del sangue. Incubare la piastra per 8 ore e contare il numero di CFU. Durante la prova dell'effetto degli antimicrobici, il fattore di diluizione appropriato deve essere raggiunto sperimentalmente.

Il design degli stampi in vetro è un'idea innovativa e originale, il cui utilizzo ci ha permesso di allevare il modello in modo coerente con problemi minimi/nessun problema di contaminazione. Gli stampi sono stati preparati da un soffiatore di vetro dell'Università di Sheffield sulla base di un progetto(Figura 1A). La configurazione sperimentale mantiene la forma convessa della cornea e trattiene i batteri sulla parte superiore dell'epitelio in cui avviene l'infezione (Figura 1B).

Le cornee suina di solito si gonfiano dopo pochi giorni a medio. Questo è normale e abbiamo scoperto che non c'era alcuna differenza significativa tra cornee con e senza aggiunta di dextran, che di solito viene aggiunto per prevenire il gonfiore della cornea(Figura 1H). Le cornee sono tipicamente ferite per aiutare i batteri a penetrare nell'epitelio. Sebbene non vi sia stata alcuna differenza significativa nel progresso dell'infezione tra cornee ferite (tagliate) e non losse (non tagliate), abbiamo notato più variazioni tra le repliche nelle cornee non tagliate(figura 1C). Lavare le cornee due volte con PBS rimuove i batteri in eccesso che non si attaccavano all'epitelio. C'è stata una differenza significativa nella CFU tra cornee suine lavate e non lavate infettate da P. aeruginosa PAO1 per 24 ore(figura 1D). Non vi è stata alcuna differenza significativa nel numero di CFU tra cornee suine e coniglio infettate da PA14 e PAO1(figura 1E,1F). I risultati per entrambi i modelli erano riproducibili. Dopo 24 ore, la cornea infetta da entrambi i ceppi pseudomonas sviluppa sempre opacità e l'area di taglio diventa più visibile e aperta rispetto alla cornea non infetta (Figura 1G) .

Figura 1: Ex vivo cornea infettato da Pseudomonas aeruginosa. (A) Immagine schematica di uno stampo di vetro utilizzato per mantenere la forma della cornea e facilitare l'introduzione di batteri e trattamenti. Lo spessore degli stampi in vetro è di 1,5 mm ed è lo stesso dello spessore delle provette realizzate in vetro borosilicato. (B)Quadro schematico dell'insieme sperimentale. (C) Verifica dell'effetto del mento sul conteggio finale della CFU dopo l'omogeneizzazione. Le cornee non tagliate (n = 16) e tagliate (n = 28) sono state infettate da P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 per 24 ore. Le cornee sono state lavate con 1 mL di PBS prima dell'omogeneizzazione. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (D) Testare l'effetto del lavaggio delle cornee con 2 x 1 mL di PBS (n = 6) e non del lavaggio (n = 6) sul conteggio finale della CFU dopo l'infezione da P. aeruginosa PAO1 per 24 ore. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (E) Numero finale di CFU nelle cornee suine infettate da P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 per 24 ore (n = 10). Le cornee sono state lavate e tagliate. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (F) Conteggio finale della CFU nelle cornee di coniglio infettate da P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 per 24 ore (n = 6). Le cornee sono state lavate e tagliate. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (G) Immagini di cornee suine ex vivo infettate da P. aeruginosa PAO1 per 24 ore. Il controllo è stato ferito ma non sono stati aggiunti batteri. Le cornee infette furono ferite e10 7 CFU furono aggiunti al lato tagliato. Nessun CFU è stato recuperato dalla cornea di controllo. (H) CFU finale recuperato dopo 24 ore di infezione da P. aeruginosa PAO1 da cornee trattate con destro (n = 2) e quelle senza dextran (n = 9). Le cornee sono state lavate e tagliate. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.