Misurare la motilità delle colture e il passaggio di cibo in Drosophila

La maggior parte degli animali hanno un tubo digestivo chiamato tratto gastrointestinale (GI) per assorbire energia e sostanze nutritive dall'ambiente. Il tratto di GI umano è composto da quattro parti: l'esofago, lo stomaco, l'intestino tenue e l'intestino crasso (colon). Il passaggio alimentare dallo stomaco all'intestino è essenziale per l'assorbimento dei nutrienti. Alcuni effetti, come l'invecchiamento, farmaci tossici, e l'infezione, causano la motilità del tratto GI disordinato e lo svuotamento gastrico, che è legato ad alcune malattie e ai loro sintomi come la dispepsia, la malattia del reflusso gastroesofageo, e costipazione¹.

La mosca della frutta (Drosophila melanogaster) è un animale modello ampiamente usato nella ricerca biomedica grazie alla sua facile manipolazione genetica. È importante sottolineare che circa il 77% dei geni associati alla malattia umana ha un omologa nella Drosophila². La ricerca con la Drosophila ha fatto enormi progressi nella nostra comprensione di molti meccanismi di malattia. Come potente organismo modello genetico, la Drosophila è ampiamente utilizzata nella ricerca sul tratto GI³. La Drosophila ha un tratto digestivo più semplice, che è diviso in tre domini discreti: budello, midgut e hindgut⁴. Il raccolto, una parte del foregut, è una struttura simile a un sacchetto che funge da sito per lo stoccaggio di cibo ingerito. Il midgut è un tubo lungo e funziona come il sito per la digestione alimentare e l'assorbimento dei nutrienti attraverso lo strato epiteliale, che consiste di enterociti addominali (EC) e cellule di enteroendocrina secretory (EE)⁵. È interessante notare che la funzione dello stomaco in Drosophila è divisa in due parti: le funzioni delle colture come conservazione degli alimenti e la regione delle cellule di rame (CCR) è una regione altamente acida con un pH < 3⁶. In Drosophila, il cibo ingerito viene inizialmente spostato al raccolto e successivamente pompato nel mezzo budello⁷. Così, la coltura svolge un ruolo fondamentale nel passaggio del cibo. Avvolto da muscoli viscerali e costituito da una complessa gamma di valvole e sfinteri, il raccolto continua a contrarre e spostare il cibo nel midgut per un'ulteriore digestione.

Questo protocollo consente di rilevare il movimento alimentare dalla coltura al midgut in Drosophila. La contrazione delle colture viene valutata contando la frequenza di contrazione del raccolto. Inoltre, l'effetto della coltura sul passaggio degli alimenti viene studiato rilevando la distribuzione degli alimenti tra colture e intestini. Inoltre, la distribuzione degli alimenti può essere utilizzata per riflettere il movimento alimentare immediato o lo stato degli alimenti di base utilizzando diversi periodi di alimentazione. Nel loro insieme, questo protocollo fornisce metodi per valutare rapidamente la motilità delle colture e il passaggio di cibo nella Drosophila.

1. Mantenere e preparare mosche sperimentali

1. Mantenere le mosche nelle fiale contenenti 10 mL di cibo appena fatto (1% agar, 2,4% di lievito di birra, 3% di saccarosio, 5% farina di mais) in un'incubatrice a 25 gradi centigradi con 60% di umidità. Impostare il ciclo di luce dell'incubatrice su 12-h luce:12-h scuro.
2. Per garantire che un gran numero di mosche genotipi ospicano desiderate si chiuda simultaneamente, la coltura giovani mosche (1/3 giorni) nel cibo standard con lievito secco sulla superficie per 3 giorni. Trasferire gli adulti in una nuova fiala di cibo con cibo standard tra cui lievito bagnato, per 2 giorni per consentire la deposizione delle uova. Lasciare le uova nell'incubatrice per sviluppare e trasferire mosche adulte in una nuova fiala per raccogliere più uova.
3. Raccogliere le mosche maschili o femminili e la coltura in nuove fiale con cibo standard alle condizioni di manutenzione per l'età desiderata.
   NOTA: Per ottenere più mosche della stessa età, possono essere configurate contemporaneamente più fiale del genotipo desiderato. Le fiale per la cultura delle mosche adulte dovrebbero essere cambiate ogni 3-5 giorni.

2. Conteggio delle contrazioni delle colture

1. Anestesizzare le mosche con CO₂ e prendere una mosca in una piastra di dissezione contenente 200 -L di 1x fosfato buffered saline (PBS, pH 7.4) composta da 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄e 1,76 mM KH₂₄.
2. Afferra la mosca al suo torace usando un paio di pinzette, apri il torace senza problemi usando un altro paio di pinzette, quindi tira l'estremità in direzioni opposte per aprire l'addome. Prendere il raccolto e l'intestino fuori dal corpo con attenzione.
3. Attendi che la mosca si svegli e quindi visualizza il raccolto e conta il numero di volte in cui si contrae in 1 min.
   NOTA: solo un'onda completa sui lobi delle colture viene conteggiata come una contrazione.
4. Ripetere il passaggio 2.3 per 5x tra intervalli 30 s.
5. Calcolare il numero medio di contrazioni delle colture al minuto.
   NOTA: Durante il conteggio della contrazione, la mosca deve essere viva e l'intestino deve essere intatto e attaccato alle estremità anteriori e posteriori dopo la dissezione.

3. Preparazione del cibo tato

1. Pesare e sciogliere il colorante blu (Tabella dei materiali) in PBS ad una concentrazione del 20% (w/v).
2. Aggiungere il 20% di colorante blu nel cibo di manutenzione del liquido bollito (fase 1.1) con una diluizione 1:40 a una concentrazione finale dello 0,5% (w/v) durante il processo di raffreddamento degli alimenti.
   NOTA: Il colorante blu viene aggiunto prima del raffreddamento e mescolato bene con agitazione. È facoltativo sciogliere il coloranti blu in PBS; acqua distillata è anche adatto.

4. Alimentazione vola con cibo tinto

1. Trasferire gruppi di mosche della stessa età verso le fiale con cibo da fame (1% agar in acqua distillata) per 4 h per garantire l'assunzione di cibo.
2. Trasferire le mosche a nuove fiale con cibo tinto blu e cultura le mosche per il tempo desiderato.
   NOTA: Il tempo di alimentazione è un fattore critico e dipende dallo scopo della ricerca. L'alimentazione breve, entro il tempo di passaggio del cibo, può essere utilizzata per valutare la velocità della motilità alimentare da coltura a intestino. Alle condizioni di manutenzione, il cibo passa attraverso in circa 2 h. Tuttavia, il tempo di passaggio potrebbe essere correlato alle condizioni culturali. L'alimentazione lunga, fino a pochi giorni, può essere utilizzata per valutare lo stato persistente di distribuzione degli alimenti tra coltura e intestino.

5. Dissezione mosche e raccolta di campioni di tintura in coltura e budello

1. Anestesizza recitaro le mosche con CO₂ e prendere una mosca in una piastra di dissezione contenente 200 -L di 1x PBS.
2. Afferra la mosca al suo torace usando un paio di pinzette e togli la testa dal corpo usando un altro paio di pinzette. Spostare il corpo rimanente in un nuovo pozzo contenente 200 -L di 1x PBS.
3. Lavare il corpo 2x scuotendolo delicatamente in 200 gradi l-l di 1x PBS utilizzando un paio di pinzette per pulire il tinrito attaccato al corpo della mosca.
4. Aprire delicatamente e senza problemi l'addome utilizzando due paia di pinzette e separare con cura l'intero intestino dal corpo.
5. Togliere con cura il raccolto da tutto l'intestino e metterlo in un tubo con 100 -L di 1x PBS.
6. Infine, mettere l'intera budello senza raccolto (qui dopo indicato come intestino) in un altro tubo con 100 -L di 1x PBS.
7. Macinare il raccolto e sventrare rispettivamente in tubi utilizzando punte di pipetta per fare in modo che il colorante si dissolva nel PBS.
8. Ripetete i passaggi 5,1/5,7 fino a quando non vengono raccolte abbastanza colture e budella per l'esperimento progettato.
   NOTA: Il raccolto e l'intestino devono essere completamente omogeneizzati e tutti i tincoli devono essere sciolti nel buffer. Per scopi di ricerca, una o più colture o budella possono essere raccolti in un tubo.

6. Calcolo delle quantità di tintura in coltura e budello

1. Centrifugare i tubi campione alla massima velocità per 1 min e trasferire 90 l di supernatant ai pozzi di una piastra di 96 pozze.
2. Effettuare una serie di diluizioni di coloranti blu a concentrazioni da 1 x 10^-7 g/mL a 1 x 10^-4 g/mL come standard.
3. Aggiungere una serie di 90 standard l ai pozzi del pozzo 96.
4. Misurare l'assorbimento dei campioni e degli standard a 630 nm con uno spettrofotometro a piastre.
5. Per creare una curva standard, tracciare un grafico a linee di assorbimento rispetto alla concentrazione per ciascuno degli standard. Quindi disegnare una linea di adattamento attraverso i punti per ottenere l'equazione utilizzata per calcolare la concentrazione di tintura nei campioni.
6. Calcolare la quantità di tintura moltiplicando la concentrazione del campione per 0,1 mL.

Questi metodi per contare la velocità di contrazione delle colture e rilevare la distribuzione degli alimenti tinto possono essere utilizzati per valutare la funzione delle colture sulla motilità degli alimenti. La contrazione del raccolto riflette la frequenza di spingere il cibo nell'intestino. La distribuzione del colorante nella mosca dopo un breve periodo di alimentazione indica il passaggio immediato del cibo dal raccolto al midgut.

Obiettivo di rapamicicina complesso 1 (TORC1) è un regolatore principale che media nutrienti e metabolismo cellulare. L'inibizione TORC1 estende la durata della vita in molti organismi, tra cui la Drosophila. Come inibitore di TORC1, la mosca mutante nprl2 mostra l'iperattivazione dei difetti di digestione TORC1 e GI8,9. La dimensione del raccolto in un mutante nprl2 è normale a 3 giorni e ingrandita a 15 giorni di età, rispetto al suo controllo genetico dello sfondo (yw)8. Per valutare il test sulla motilità delle colture, sono state utilizzate mosche mutanti e controlli di yw di 3 giorni. yw Ogni coltura è stata conteggiata cinque volte ed è stato utilizzato il valore medio(tabella supplementare 1). Il numero della contrazione delle colture durante le cinque ripetizioni era simile, il che suggerisce che la PBS potrebbe non influenzare la fisiologia delle colture in brevi poppate ed è adatta per il conteggio della contrazione delle colture. La mutazione nprl2 ha ridotto significativamente il tasso di contrazione delle colture (Figura 1).

Simile allo stomaco dei mammiferi, il raccolto della Drosophila continua a contrarsi per spostare il cibo nell'intestino. Per confermare ulteriormente la funzione di Nprl2 sulla coltura, è stato rilevato il movimento alimentare. Le mosche sono state alimentate con cibo tinto per 30 min e sezionato immediatamente per rilevare la quantità di colorante nel raccolto e l'intestino utilizzando la spettrofotometria. Come mostrato nella Figura 2A, le quantità di colorante blu nelle colture di controllo e i mutanti nprl2 erano simili, in linea con la dimensione comparabile delle colture8. I mutanti nprl2 avevano meno tintura nell'intestino, che può essere associata alla diminuzione del tasso di contrazione (Figura 2B).

Figura 1: Differenza di contrazione delle colture tra il controllo e i maschi mutanti nprl2. Le mosche maschili di 3 giorni sono state sezionate e il tasso di contrazione del grano è stato contato. La frequenza di contrazione del ritaglio di ogni mosca viene visualizzata come punto dati. Le barre di errore rappresentano SD dal punto dati indicato. , P < 0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Differenza di distribuzione alimentare tra il controllo e i maschi mutanti nprl2 dopo un breve tempo di alimentazione. Le mosche maschili di 3 giorni sono state alimentate con cibo contenente 0,5% di colorante blu per 30 min e poi sezionato immediatamente per rilevare la quantità di colorante. (A) La quantità di colore nel raccolto. (B) La quantità di tinri nell'intestino senza raccolto. P < 0,01; NS, non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: I dati originali di contrazione del raccolto utilizzati nella Figura 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.