Summary

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Published: September 09, 2020
doi:

Summary

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un’incidenza del 100%. L’iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l’embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l’impianto di innesto tumorale solido nell’osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Abstract

I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o osteolitiche / osteoblastiche miste. Queste lesioni compromettono la struttura ossea, aumentano il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che con molti tumori solidi, le cellule tumorali che si sono diffuse alle ossa possono essere la fonte primaria di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. La maggior parte dei modelli murini singeneici o xenograft di tumori ossei primari comportano l’iniezione intra-ossea (ortotopica) di sospensioni di cellule tumorali. Alcuni modelli animali di metastasi scheletriche da tumori solidi dipendono anche dall’iniezione ossea diretta, mentre altri tentano di ricapitolare ulteriori passaggi della cascata metastatica ossea iniettando cellule intravascolarmente o nell’organo del tumore primario. Tuttavia, nessuno di questi modelli sviluppa metastasi ossee in modo affidabile o con un’incidenza del 100%. Inoltre, è stato dimostrato che l’iniezione intraossea diretta di cellule tumorali è associata a una potenziale embolizzazione tumorale del polmone. Queste cellule tumorali emboliche si innestano ma non ricapitolano la cascata metastatica. Abbiamo riportato un modello murino di osteosarcoma in cui frammenti tumorali freschi o crioconservati (costituiti da cellule tumorali più stroma) vengono impiantati direttamente nella tibia prossimale utilizzando una tecnica chirurgica minimamente invasiva. Questi animali hanno sviluppato attecchimento riproducibile, crescita e, nel tempo, osteolisi e metastasi polmonari. Questa tecnica ha la versatilità per essere utilizzata per modellare metastasi ossee tumorali solide e può facilmente impiegare innesti costituiti da uno o più tipi di cellule, cellule geneticamente modificate, xenotrapianti derivati dal paziente e / o cellule marcate che possono essere monitorate mediante imaging ottico o avanzato. Qui, dimostriamo questa tecnica, modellando i tumori ossei primari e le metastasi ossee utilizzando l’impianto di innesto tumorale solido nell’osso.

Introduction

I modelli murini di malattie umane e animali stanno diventando sempre più popolari nella ricerca biomedica. L’utilità di usare i topi in questo contesto è che la loro anatomia e fisiologia sono molto simili agli esseri umani. Hanno un periodo di gestazione relativamente breve e un tempo nella vita post-natale per raggiungere la maturità e sono in gran parte associati a un costo relativamente basso e alla facilità di alloggio, sebbene l’aumento dei costi di sviluppo o acquisto sia associato a maggiori gradi di modificazione genetica, immunodeficienza e / o umanizzazione1. L’uso di ceppi inbred si traduce in una popolazione animale ampiamente uniforme prima dell’inclusione nello studio. Una conoscenza completa del loro genoma suggerisce un alto grado di somiglianza con gli esseri umani. Nel genoma del topo sono stati identificati bersagli molecolari ortologhi per molti processi patologici e ora esiste una vasta libreria di reagenti specifici per il topo che sono facilmente ottenibili. Pertanto, offrono l’opportunità di analisi a produttività relativamente elevata in modo più rapido e meno costoso rispetto ai modelli animali più grandi1. Inoltre, con l’avvento di strategie di editing genetico che consentono la sovraespressione o la delezione di determinati geni sia globalmente che in modo specifico di un tipo cellulare e/o costitutivamente o in modo inducibile, rappresentano un sistema modello biologicamente molto utile per lo studio delle malattie umane e animali2.

Il cancro è un campo in cui i modelli murini hanno una grande utilità. I modelli genetici murini di cancro si basano sulla modulazione dell’espressione di oncogeni o geni oncosoppressori, da soli o in combinazione, affinché le cellule subiscano una trasformazione oncogena. Viene eseguita anche l’iniezione di linee cellulari tumorali primarie o stabilite nei topi. L’introduzione di linee cellulari o tessuti da esseri umani o altre specie animali, compresi i topi, rimane il modello di cancro più utilizzato in vivo. L’uso di cellule e tessuti di specie dissimili (xenotrapianti) in topi immunocompromessi è più comunemente eseguito2. Tuttavia, l’uso di cellule o tessuti tumorali allogenici in cui sia l’ospite che il ricevente sono della stessa specie consente l’interazione con un sistema immunitario intatto quando combinato con lo stesso ceppo di topo ospite nei sistemi singeneici3.

I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o miste osteolitiche/osteoblastiche dolorose 3,4. Questi tumori compromettono la struttura ossea, aumentando il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Nelle pazienti con carcinoma mammario, l’osso è il sito più comune di prima metastasi e il più frequente primo sito di presentazione della malattia metastatica 5,6. Inoltre, le cellule tumorali disseminate (DTC) sono presenti nel midollo osseo prima della diagnosi e predicono lo sviluppo di metastasi in altri organi7. Pertanto, si ritiene che le cellule tumorali presenti nelle ossa siano la fonte di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. Esistono molti modelli murini di metastasi tumorali solide che sviluppano metastasi prevalentemente nei polmoni e nei linfonodi e, a seconda del tipo di tumore e della tecnica di iniezione, potenzialmente altri sistemi di organi3. Tuttavia, mancano modelli murini di metastasi ossee che producano in modo affidabile e riproducibile metastasi scheletriche specifiche del sito e sviluppino metastasi ossee prima che i topi raggiungano i criteri di rimozione precoce dal carico tumorale primario o dalle metastasi ad altri organi. Abbiamo riportato un modello di osteosarcoma tumorale osseo primario che si basa sull’impianto chirurgico di un allotrapianto tumorale solido nella tibia prossimale dei topi8. I tumori ossei si sono formati nel 100% dei topi e l’88% ha sviluppato metastasi polmonari. Questa incidenza di metastasi supera quanto comunemente riportato clinicamente nelle persone (~20-50%), ma è di grande interesse poiché il polmone è il sito più comune di metastasi per l’osteosarcoma 9,10,11. Mentre questo modello è vantaggioso nella modellazione dei tumori ossei primari, ha anche una grande utilità nella modellazione delle metastasi ossee da altri tumori solidi osteotropi come tumori al seno, polmone, prostata, tiroide, epatici, renali e gastrointestinali.

Il razionale per lo sviluppo di questo modello era quello di sviluppare un’alternativa alla tradizionale iniezione intra-ossea tipicamente nella tibia prossimale o nel femore distale per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee12. Il nostro obiettivo primario era quello di alleviare una limitazione nota di questa tecnica, cioè l’embolizzazione tumorale del polmone. Ciò si traduce nell’attecchimento di queste cellule tumorali emboliche e “metastasi artifattuali” che non ricapitolano la cascata metastatica completa da un tumore osseo primario stabilito che metastatizza ai polmoni 8,13. Questa sarebbe anche la situazione in cui una metastasi ossea stabilita si diffonde in un sito distante. Inoltre, questa tecnica è stata sviluppata anche per produrre un modello di metastasi ossee che garantisse una maggiore incidenza di attecchimento e crescita dei tumori nell’osso e in un sito uniforme rispetto alle tecniche di iniezione ortotopica o intravascolare. Questo modello presenta vantaggi distinti rispetto a queste tecniche descritte. Questo modello comporta la consegna controllata e coerente delle cellule tumorali nell’osso. Inoltre, evita metastasi polmonari artifattuali dopo l’embolizzazione polmonare e stabilisce una popolazione di studio uniforme di base. C’è il beneficio dei tumori sito-specifici con questo modello senza il rischio di criteri di rimozione precoce derivanti da tumori primari o metastasi ad altri organi. Infine, questo modello ha una grande utilità per la modifica, compreso l’uso di xenotrapianti derivati dal paziente.

Il modello presentato ha somiglianze con l’iniezione diretta di sospensione cellulare nell’osso seguendo un approccio chirurgico seguito da iniezione attraverso la corteccia o consegna nella cavità del midollo dopo aver commesso un piccolo difetto nella corteccia (con o senza alesatura della cavità midollare)8,14,15,16,17. Tuttavia, l’impianto di un allotrapianto tumorale rende questa tecnica nettamente diversa. Pertanto, lo scopo di questo rapporto era quello di dimostrare questo modello di tumori ossei primari e metastasi ossee da tumori solidi, che supera molte limitazioni dei modelli precedentemente descritti. I gruppi di ricerca con esperienza in colture cellulari, modelli murini, anestesia e chirurgia del topo e anatomia del topo sono ben attrezzati per riprodurre la nostra tecnica per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee nei topi.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università di Cambridge, Cambridge, Regno Unito. 1. Preparazione di linee cellulari Coltivare linee cellulari in conformità con i protocolli di coltura cellulare standard del laboratorio per la coltura cellulare tradizionale o l’iniezione nei topi. I protocolli standard utilizzati qui sono la crescita nel terreno di coltura modificato di Eagle di Dulb…

Representative Results

Un risultato positivo sarebbe associato all’attecchimento del tumore e alla crescita progressiva del tumore nel tempo. A seconda del tipo di tumore, la crescita tumorale intraossea può essere associata a zoppia progressiva degli arti posteriori, ma molti tumori non causano zoppia nonostante i segni di malattia ossea associata. L’attecchimento riuscito è stato documentato con imaging avanzato, per cui ci sarebbero cambiamenti radiografici, μTC o μMRI progressivi nella tibia prossimale associata al fenotipo osseo della…

Discussion

Questo rapporto documenta il nostro modello per creare tumori ossei primari o metastasi ossee dopo l’impianto intratibiale di un allotrapianto tumorale. Riteniamo che ci siano diversi passaggi critici in questo processo. Deve essere stabilito un piano anestetico sicuro sia per l’iniezione sottocutanea della sospensione delle cellule tumorali che per il posizionamento intratibiale dei frammenti tumorali risultanti. Ci dovrebbe essere una preparazione sterile del sito chirurgico sia per la rimozione dell’allotrapianto sott…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il contributo critico della dott.ssa Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP allo sviluppo di questa tecnica.

Materials

#15 scalpel blade Henry Schein Ltd. 75614 None
6-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 10578911 Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line Not applicable Not applicable None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) VetEquip 901805 None
Animal weighing scale Kent Scientific SCL- 1015 None
BALB/c nude mouse (nu/nu) Charles River Ltd. NA 6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement Depuy Synthes 160504 Optional use instead of bone wax
Bone wax Ethicon W31G Optional
Buprenorphine Animalcare Ltd. N/A Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station N/A N/A Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide Heraeus Various None
Chlorhexidine surgical scrub Vetoquinol 411412 None
Cryovials (2 ml) Thermo Scientific Nalgene 5000-0020 Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt Perkin Elmer 122799 Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper Mitutoyo 500-181-30 Can be manual
Digital microradiography cabinet Faxitron Bioptics, LLC MX-20 Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich 1371171000 Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Thermo Fisher Scientific 11965092 None
Ethanol (70%) Sigma Aldrich 2483 None
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079 None
Forceps, Dumont Fine Science Tools, Inc. 11200-33 None
Freezer (– 80 °C) Sanyo MDF-794C Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer Thermo Fisher Scientific 11704939 Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge) Henry Schein Ltd. DIS55510 May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice N/A N/A Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors Fine Science Tools, Inc. 14084-08 None
Isoflurane Henry Schein Ltd. 1182098 None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system Perkin Elmer CLS136334 Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine Thermofisher scientifc 25030081 None
Liquid nitrogen British Oxygen Corporation NA Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres Thermo Fisher Scientific TY509X1 Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml Corning Life Sciences 356230 Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002549 Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner Fisher Scientific 10110051 Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil Thermo Fisher Scientific NC0132811 Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich P4333 None
Scalpel handle, #7 Short Fine Science Tools, Inc. 10007-12 User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad VetTech HE006 None
Stereomicroscope GT Vision Ltd. H600BV1 None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023 Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile) 3M Corporation 84-1469SB Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 5250061 None
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) Becton Dickinson 309659 Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75 Corning Life Sciences CLS3290 Can also use smaller or larger flasks, as needed

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hildreth III, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone. J. Vis. Exp. (163), e61313, doi:10.3791/61313 (2020).

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