Summary

Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

Published: December 05, 2020
doi:

Summary

Le cellule staminali del cancro ovarico (OCSC) sono responsabili dell’inizio del cancro, della recidiva, della resistenza terapeutica e delle metastasi. Si ritiene che la nicchia vascolare OCSC promuova l’autorinnovamento degli OCSC, portando alla chemioresistenza. Questo protocollo fornisce la base per stabilire un modello di nicchia vascolare OCSC riproducibile in vitro.

Abstract

Le cellule staminali tumorali (CSC) risiedono in una nicchia di supporto, costituendo un microambiente composto da cellule stromali adiacenti, vasi e matrice extracellulare. La capacità delle CSCs di partecipare allo sviluppo dell’endotelio costituisce una caratteristica importante che contribuisce direttamente alla comprensione generale dei meccanismi della tumorigenesi e delle metastasi tumorali. Lo scopo di questo lavoro è quello di stabilire una metodologia riproducibile per studiare la capacità di inizio del tumore delle cellule staminali tumorali ovariche (OCSC). Qui, abbiamo esaminato il meccanismo di neovascolarizzazione tra cellule endoteliali e OCSC insieme ai cambiamenti morfologici delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura in vitro NICO-1. Questo protocollo consente di visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda gli OCSC in modo temporizzato. La tecnica può fornire informazioni sulle proprietà angiogenetiche degli OCSC nelle metastasi tumorali.

Introduction

Il cancro ovarico è l’ottavo tumore maligno più comune nelle donne in tutto il mondo, con circa 300.000 nuove diagnosi e circa 180.000 decessi all’anno1. Alla diagnosi iniziale, il carcinoma ovarico si presenta spesso con sintomi gravi, con circa il 75% delle pazienti già allo stadio III-IV. Di conseguenza, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è del <30% e il tasso di mortalità è il più alto tra i tumori ginecologici2, con l’efficacia del trattamento per il cancro ovarico che dipende fortemente da fattori clinici come il successo della chirurgia di debulking, la resistenza alla chemioterapia e la recidiva dopo la terapia iniziale.

I tessuti del cancro ovarico sono organizzati gerarchicamente, con non tutti i componenti tumorali ugualmente in grado di generare discendenti. Le uniche cellule in grado di auto-rinnovarsi e produrre una popolazione eterogenea di cellule tumorali sono considerate cellule staminali tumorali (CSCs)3. L’auto-rinnovamento delle CSC e l’iniziazione del tumore sono accompagnati dalla promozione dell’angiogenesi per rimodellare il loro microambiente tumorale allo scopo di mantenere una nicchia di supporto. Tuttavia, i modelli precedenti non potevano essere utilizzati per le analisi in vitro a causa della limitata riproducibilità della coltivazione di CSCs derivate da campioni clinici a causa della rottura degli sferoidi dopo passaggi multipli. Più recentemente, sono stati sviluppati metodi sperimentali per coltivare CSC da pazienti per diverse applicazioni 4,5,6,7. In particolare, sfruttando la caratteristica delle CSCs di crescere formando sferoidi in piastre di attacco ultra-basse con mezzo privo di siero, le CSCs coltivate sono indotte ad esprimere un marcatore di superficie staminale che non è espresso in cellule tumorali normali con potenziale di differenziazione multilineage 8,9.

Dati recenti hanno dimostrato che la persistenza di (O)CSCs ovariche dormienti visualizzate come disseminazione al peritoneo è associata alla loro rigenerazione come tumori ricorrenti10. La comprensione delle caratteristiche molecolari e biologiche degli OCSC può quindi consentire un efficace targeting ed eradicazione di queste cellule, con conseguente potenziale remissione del tumore. In particolare, poco si sa riguardo alle caratteristiche meccanicistiche cellulari e molecolari dei ruoli delle CSCs nell’angiogenesi11. Pertanto, nel presente protocollo abbiamo utilizzato OCSC derivati dal paziente in un setting in vitro per studiare la proprietà angiogenica delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura, che può imitare il microambiente tumorale delle CSCs e delle cellule endoteliali nel sito metastatico in ambito clinico. In definitiva, poiché la neovascolarizzazione costituisce un processo critico necessario per supportare la crescita tumorale e le metastasi, una migliore comprensione del suo meccanismo consentirà lo sviluppo di una nuova terapia mirata per gli OCSC nel sito metastatico.

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda le CSC in un modo di tempo. Il vantaggio del protocollo include la possibilità di indagini completamente riproducibili utilizzando il sistema di co-coltura 3D, NICO-1, consentendo così l’osservazione degli effetti sui pazienti della capacità di iniziazione del tumore derivata da OCSC durante l’angiogenesi delle cellule endoteliali.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal Comitato etico per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l’uso della ricerca dei loro campioni e la raccolta e l’uso dei tessuti per questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per la ricerca sul genoma umano, analisi genica dell’Università di Teikyo. 1. Isolamento e coltura di cellule staminali tumorali ovariche (OCSC) da pazienti con carcinoma ovarico e ascite in…

Representative Results

Abbiamo raccolto fluidi asciti ottenuti da pazienti con carcinoma ovarico avanzato durante l’intervento chirurgico o la paracentesi allo scopo di eseguire una coltura stabile a lungo termine per gli sferoidi. Qui, presentiamo casi di una coltura sferoide a lungo termine di CSCs ovariche denominate CSC1 e CSC2. Entrambe le linee cellulari portano la stessa diagnosi e gli stessi profili istologici. I ruoli meccanicistici degli OCSC alla base dell’interazione con le cellule endoteliali neces…

Discussion

Il protocollo presentato descrive come imitare il microambiente tumorale degli OCSC in un ambiente in vitro. La componente principale del metodo è costituita dal modello di cocoltura altamente riproducibile ottenuto utilizzando il sistema NICO-1, un sistema di co-coltura Transwell indiretto. Molti dei modelli di cocoltura attualmente disponibili esaminano gli effetti del contatto diretto cellula-cellula sulle popolazioni cellulari di cocoltura 12,13,14,15,16,17,18.</s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant no. 19K09834 to K.N.) del Ministero dell’Istruzione, della Scienza e della Cultura, Giappone.

Materials

0.025% Trypsin  Thermo R001100
10 mL Pipet Thermo 170356N
1250 µL Pipet tip QSP T112XLRS-Q
15 mL tube Nunc 339650
200 µL Pipet tip QSP T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol Thermo (Gibco) 21985023
5 mL Pipet Thermo 170366N
50 mL tube Corning 430290
AccuMAX Innovative Cell Technologies AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish Corning 356401
Centrifuge KUBOTA 2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
Endothelial Cell Growth Medium 2  PromoCell C-22011 
Ethanol WAKO 057-00456
FGF-Basic Thermo (Gibco) PHG0021
Histodenz SIGMA D2158
HUEhT-1 cell JCRB Cell Bank JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm Ginrei Lab. 2525-06
Insulin, human SIGMA (Roche) 11376497001
Luminometer PerkinElmer ARVO MX-flad
Matrigel Matrix Corning 356234
Microscope Yokogawa CQ-1
NICO-1 Ginrei Lab. 2501-02
OptiPlate-96 PerkinElmer 6005290
P1000 Pipet Gilson F123602
P200 Pipet Gilson F123601
PBS Thermo (Gibco) 14190-144
StemPro hESC SFM Thermo (Gibco) A1000701
Transfer Pipet FALCON 357575
Y-27632 WAKO 253-00513

Riferimenti

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  3. Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
  4. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  5. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  6. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  7. Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Ricerca sul cancro. 72 (19), 5101-5110 (2012).
  8. Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Ricerca sul cancro. 76 (1), 150-160 (2016).
  9. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Ricerca sul cancro. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  10. Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
  11. Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
  12. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
  13. Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
  14. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
  15. Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
  16. Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
  17. Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  18. Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
  19. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
  20. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
  21. Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
  22. Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
  23. Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).

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Citazione di questo articolo
Miyagawa, Y., Nagasaka, K., Yamawaki, K., Mori, Y., Ishiguro, T., Hashimoto, K., Koike, R., Fukui, S., Sugihara, T., Ichinose, T., Hiraike, H., Kido, K., Okamoto, K., Enomoto, T., Ayabe, T. Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1. J. Vis. Exp. (166), e61751, doi:10.3791/61751 (2020).

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