Summary

Imaging live ad alta produttività di microcolonie per misurare l'eterogeneità nella crescita e nell'espressione genica

Published: April 18, 2021
doi:

Summary

I fenotipi di crescita del lievito sono misurati con precisione attraverso l’imaging time-lapse altamente parallelo di cellule immobilizzate che crescono in microcolonie. Allo stesso tempo, la tolleranza allo stress, l’espressione proteica e la localizzazione delle proteine possono essere monitorate, generando set di dati integrati per studiare come le differenze ambientali e genetiche, così come l’eterogeneità gene-espressione tra le cellule isogeniche, modulano la crescita.

Abstract

Misurazioni precise dell’eterogeneità tra e all’interno dello sforzo nei tassi di crescita microbica sono essenziali per comprendere gli input genetici e ambientali nella tolleranza allo stress, nella patogenicità e in altri componenti chiave dell’idoneità. Questo manoscritto descrive un saggio basato sul microscopio che tiene traccia di circa 105 microcoloni Saccharomyces cerevisiae per esperimento. Dopo l’imaging automatizzato time-lapse del lievito immobilizzato in una piastra multiwell, i tassi di crescita dei microcoloni vengono facilmente analizzati con un software di analisi delle immagini personalizzato. Per ogni microcolonia, è anche possibile monitorare l’espressione e la localizzazione di proteine fluorescenti e la sopravvivenza dello stress acuto. Questo saggio consente una stima precisa dei tassi di crescita medi dei ceppi, nonché una misurazione completa dell’eterogeneità nella crescita, nell’espressione genica e nella tolleranza allo stress all’interno delle popolazioni clonali.

Introduction

I fenotipi di crescita contribuiscono in modo critico alla forma fisica del lievito. La selezione naturale può distinguere in modo efficiente tra lignaggi con tassi di crescita diversi dall’inverso della dimensione effettiva della popolazione, che può superare i 108 individui1. Inoltre, la variabilità dei tassi di crescita tra gli individui all’interno di una popolazione è un parametro evolutivamente rilevante, in quanto può servire come base per strategie di sopravvivenza come la copertura dellepuntate 2,3,4,5,6. Pertanto, i test che consentono misurazioni altamente accurate dei fenotipi di crescita e delle loro distribuzioni sono fondamentali per lo studio dei microrganismi. Il saggio di crescita del microcolonio qui descritto può generare misurazioni individuali del tasso di crescita per ~10 5 microcolonie per esperimento. Questo saggio fornisce quindi un potente protocollo per studiare la genetica evolutiva e la genomica del lievito. Si presta particolarmente bene a testare come la variabilità all’interno delle popolazioni di singole cellule geneticamente identiche viene generata, mantenuta e contribuisce alla forma fisicadella popolazione 7,8,9,10.

Il metodo qui descritto (Figura 1) utilizza immagini a campo luminoso a basso ingrandimento catturate periodicamente di cellule che crescono in mezzi liquidi su una piastra inferiore in vetro da 96 o 384 pozze di vetro per tenere traccia della crescita in microcolonie. Le cellule aderiscono alla lettalina concanavalina A, che rivestise il fondo della piastra del microscopio e forma colonie bidimensionali. Poiché le microcolonie crescono in un monostrato, l’area della microcolonia è altamente correlata con la cella numero7. Pertanto, è possibile generare stime accurate del tasso di crescita del microcolony e del tempo di ritardo con un software di analisi delle immagini personalizzato che tiene traccia del tasso di cambiamento dell’area di ogni microcolony. Inoltre, la configurazione sperimentale può monitorare l’abbondanza e persino le localizzazioni subcellulari di proteine etichettate fluorescentmente espresse in queste microcolonie. L’elaborazione a valle dei dati di questo test di crescita della microcolonia può essere ottenuta mediante analisi personalizzate o con il software di analisi delle immagini esistente, come Processing Images Easily (PIE)11, un algoritmo per il riconoscimento robusto dell’area della colonia e l’analisi della crescita ad alta produttività da immagini a basso ingrandimento e luminose, disponibile tramite GitHub12.

Poiché le stime del tasso di crescita derivate dal saggio di crescita della microcolonia sono generate da un gran numero di misurazioni a colonia singola, sono estremamente accurate, con errori standard di diversi ordini di grandezza più piccoli delle stime stesse per un esperimento di dimensioni ragionevoli. Pertanto, il potere del saggio di rilevare differenze di tasso di crescita tra diversi genotipi, trattamenti o condizioni ambientali è elevato. Il formato multiwell-plate consente di confrontare numerose combinazioni di ambiente e genotipo diverse in un unico esperimento. Se i ceppi esprimono in modo costitutivo marcatori fluorescenti diversi, possono essere mescolati nello stesso pozzo e distinti dalla successiva analisi dell’immagine, che potrebbe aumentare ulteriormente la potenza consentendo la normalizzazione dei dati pozzo per pozzo.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo. Questo protocollo segue due fasi principali, che sono la preparazione della piastra sperimentale e la preparazione delle cellule all’immagine. La randomizzazione delle piastre e la crescita delle cellule devono essere condotte prima e prima del giorno dell’esperimento. La miscelazione ripetuta delle cellule in ogni fase durante la diluizione è imperativa nei passaggi fino alla placcatura, e quindi si consiglia di preparare prima la piastra sperimentale in modo che sia pronta per la placcatura immediatamente dopo il completamento della diluizione cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione di piastre randomizzate (prima del giorno dell’esperimento) Pianificare i ceppi e le condizioni da testare con il test di crescita. A questo punto, assegnare casualmente ceppi e condizioni a qualsiasi pozzo.NOTA: Quando si considera la configurazione della piastra, è consigliabile includere più di una replica per sforzo e condizione di crescita su una singola piastra per tenere conto del rumore ben correlato nelle misurazioni. Per ulteriori dettagli, vedere Discussione. Randomizz…

Representative Results

La novità di questo protocollo è che il tasso di crescita può essere calcolato per le singole cellule all’interno di una popolazione monitorando la loro crescita in microcolonie attraverso l’imaging time-lapse (Figura 2A). Poiché le microcolonie crescono per molte ore in modo planare a causa della presenza di concanavalina A, le loro aree possono essere tracciate durante l’esperimento e una vestibilità lineare al cambiamento nel log naturale dell’area nel tempo può essere utilizzata pe…

Discussion

Il protocollo qui descritto è un saggio versatile che consente di monitorare simultaneamente la crescita cellulare e l’espressione genica a livello delle singole microcolonie. La combinazione di queste due modalità produce intuizioni biologiche uniche. Ad esempio, lavori precedenti hanno usato questo saggio per mostrare una correlazione negativa tra l’espressione del gene TSL1 e il tasso di crescita della microcolonia nelle cellule di tipo selvatico isogenico misurandoentrambi contemporaneame…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Naomi Ziv, Sasha Levy e Shuang Li per i loro contributi allo sviluppo di questo protocollo, David Gresham per le attrezzature condivise e Marissa Knoll per l’aiuto nella produzione video. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dei National Institutes of Health R35GM118170.

Materials

General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck Fisher CLS431154 used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom Fisher 08-772-54 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL Fisher 13-689-8 Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher 07-200-127 reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape Fisher 07-200-684 96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes Fisher 06-666A lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters ThermoFisher Scientific 199-2020 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane Millipore Sigma Z380059-1PAK breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate Dot Scientific MGB096-1-2-LG-L microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder Millipore Sigma 45-C2010-1G Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System Inverted microscope with automated stage and autofocus system

Riferimenti

  1. Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
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Citazione di questo articolo
Sartori, F. M. O., Buzby, C., Plavskin, Y., Siegal, M. L. High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression. J. Vis. Exp. (170), e62038, doi:10.3791/62038 (2021).

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