Summary

Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Published: May 25, 2021
doi:

Summary

Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l’uso di agenti bioleganti o sutura.

Abstract

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per il diabete mellito grave. La cavità intraperitoneale è tipicamente il sito di trapianto per questa procedura. Tuttavia, il trapianto di isole intraperitoneali presenta alcune limitazioni, tra cui la scarsa efficacia del trapianto, la difficile capacità di rilevamento dell’innesto e la mancanza di capacità di graftectomia per l’analisi post-trapianto. In questo articolo, “trapianto di isole ricoperte di grasso”, un metodo di trapianto di isole intraperitoneali che utilizza tessuto adiposo bianco epididimale, viene utilizzato per valutare gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate. La semplicità del metodo sta nella semina di isole sul tessuto adiposo bianco dell’epididimo e nell’utilizzo del tessuto per coprire le isole. Mentre questo metodo può essere classificato come una tecnica di trapianto di isole intraperitoneali, condivide le caratteristiche con il trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Tuttavia, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso dimostra effetti terapeutici più robusti rispetto al trapianto di isole di tessuto intra-adiposo, compreso il miglioramento dei livelli di glucosio nel sangue e di insulina plasmatica e il potenziale di rimozione del trapianto. Si consiglia l’adozione di questo metodo per valutare i meccanismi di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco e gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.

Introduction

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per i pazienti con diabete mellito grave. Recenti rapporti hanno dimostrato che i tassi di insulino-indipendenza a tre anni dal trapianto migliorano fino al 44%1 e che circa l’80% dei riceventi che ricevono più di 600.000 equivalenti insulari totali raggiungono l’insulino-indipendenza2. Inoltre, nel più recente rapporto del Collaborative Islet Transplant Registry, è stato rivelato che i livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati mantenuti a 60-140 mg / dL per un periodo di 5 anni in oltre il 70% dei pazienti sottoposti a trapianto di isole da solo. Lo studio ha anche determinato che circa il 90% dei pazienti che hanno ricevuto il trapianto di isole da solo o il trapianto di isole dopo trapianto di rene non hanno sviluppato eventi ipoglicemici gravi per oltre 5 anni3.

Sebbene i risultati clinici di questo trattamento siano migliorati, alcune limitazioni devono ancora essere affrontate, inclusa la necessità di stabilire un sito di trapianto ottimale. Il fegato è un tipico sito di trapianto per il trapianto di isole cliniche perché è l’organo più grande che può ospitare un elevato volume di isole. Tuttavia, in alcuni pazienti il fegato non è disponibile (ad esempio, a causa di ipertensione portale, epatite e / o cirrosi4) e quindi altri siti, tra cui lo spazio subcapsulare renale5,6, la sacca omentale 7,8,9,10, il mesentere 11, il tratto gastrointestinale 12, il muscolo scheletrico 13, il tessuto sottocutaneo 13, il midollo osseo14 e la milza 15 ,16,17, sono stati considerati come siti di trapianto alternativi.

Sebbene il trapianto intraperitoneale di isole possa essere eseguito facilmente in anestesia locale, rendendo la cavità intraperitoneale un sito attraente per il trapianto clinico di isole, al momento del trapianto, le isole sono disperse in tutta la cavità intraperitoneale, rendendo difficile il rilevamento dell’attecchimento delle isole e la conferma dell’attecchimento di successo. Pertanto, la cavità intraperitoneale non è ampiamente riconosciuta come sito di trapianto clinico ideale. Invece, è spesso utilizzato come modello di controllo per studi preclinici per studiare l’efficacia delle isole trapiantate incapsulate18 e bioingegnerizzate19. Tuttavia, un confronto esatto tra isole bioingegnerizzate e di controllo è difficile da ottenere a causa delle difficoltà nell’eseguire una valutazione accurata dell’attecchimento.

Al contrario, l’uso di tessuto adiposo bianco intraperitoneale nella sacca omentale8, nel mesentere e in altre sedi extraepatiche è stato ben riportato 10,20,21,22,23 e molti degli studi che hanno studiato la funzione delle isole bioingegnerizzate trapiantate utilizzando tessuto adiposo bianco sono stati in grado di riportare risultati terapeutici promettenti20,24,25, 26. Poiché l’uso del tessuto adiposo epididimo facilita la rilevazione delle isole trapiantate, il “metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso”, utilizzando tessuto adiposo epididimale, è stato sviluppato per superare i limiti del trapianto di isole intraperitoneali. In questo articolo viene descritto il trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo epididimale.

Protocol

La procedura seguente viene eseguita in tre passaggi. Il primo passo include l’induzione del diabete nei topi riceventi e l’isolamento delle isole donatrici. Il secondo passo prevede la preparazione delle isole prima del trapianto. Nella terza fase, viene eseguito il trapianto di isole sul tessuto adiposo epididimo e la copertura delle isole utilizzando il tessuto adiposo. Successivamente, sono stati valutati gli effetti terapeutici. La manipolazione dei topi e le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono con…

Representative Results

Per confrontare l’efficacia del trapianto di isole ricoperte di grasso con quella dopo il trapianto di isole intraperitoneali, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali (p = 0,0023; Figura 3A)…

Discussion

Il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso incorpora tecniche di due diverse tecniche di trapianto: trapianto di isole intraperitoneali e trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Poiché la membrana superficiale del tessuto adiposo bianco dell’epididimo è considerata il tessuto adiposo bianco coperto dal peritoneo e che è attaccato all’epididimo, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso può essere anatomicamente classificato come un tipo di trapianto di isole intraperitoneali. La tecnica con cu…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato da un Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) del Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone.

Materials

4-0 Nylon Alfresa ER2004NA45-KF2 Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig Jackson Immunoresearch 706-546-148 Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate ThermoFisher Scientific 11885084 Culturing islets, transplanting islets
Eosin Fujifilm Wako Chemicals 051-06515 Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086 Collecting islets 
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352095 Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070 Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) IR002 Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin Muto Pure Chemicals Co., Ltd. 30002 Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10% Shionogi&Co., Ltd. no catalog number Using for disinfection
Isoflurane Fujifilm Wako Chemicals 095-06573 Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips Labcon 1177-965-008 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips Labcon 1179-965-008 Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., 8AEB02E Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000 Gilson F123602 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200 Gilson F123601 Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF Abcam ab6994 Primary antibody for murine von Willebrand factor

Riferimenti

  1. Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  2. Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
  3. Collaborative Islet Transplant Registry. . Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
  4. Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
  5. Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
  6. Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
  7. Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation–a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
  8. Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
  9. Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
  10. Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
  11. Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
  12. Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
  13. Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
  14. Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
  15. White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
  16. Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
  17. Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
  18. Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
  19. Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
  20. Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
  21. Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
  22. Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
  23. Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
  24. Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
  25. Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
  26. Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
  27. Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
  28. Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
  29. Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
  30. Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
  31. Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
  32. Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
  33. Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
  34. Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
  35. Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
  36. Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).

Play Video

Citazione di questo articolo
Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kawakami, R., Kodama, S. Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (171), e62096, doi:10.3791/62096 (2021).

View Video