Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l’analisi del comportamento tumorale, l’immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell’imaging confocale.
Gli xenografti larvali zebrafish sono ampiamente utilizzati per la ricerca sul cancro per eseguire studi in vivo e in tempo reale sul cancro umano. La possibilità di visualizzare rapidamente la risposta alle terapie anti-cancro (chemio, radioterapia e biologia), angiogenesi e metastasi con risoluzione a singola cellula, pone il modello xenograft zebrafish come la scelta migliore per sviluppare studi preclinici.
Il saggio di xenograft larvale zebrafish presenta diversi vantaggi sperimentali rispetto ad altri modelli, ma probabilmente il più sorprendente è la riduzione della scala delle dimensioni e di conseguenza del tempo. Questa riduzione della scala consente l’imaging a singola cellula, l’uso di un numero relativamente basso di cellule umane (compatibili con le biopsie), screening farmacologici a media-alta produttività, ma soprattutto consente una significativa riduzione del tempo del saggio. Tutti questi vantaggi rendono il saggio di xenograft zebrafish estremamente attraente per le future applicazioni di medicina personalizzata.
Molti protocolli di xenoinnesto zebrafish sono stati sviluppati con un’ampia varietà di tumori umani; tuttavia, manca ancora un protocollo generale e standardizzato per generare in modo efficiente xenografti larvali di zebrafish. Qui forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l’analisi del comportamento tumorale, l’immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell’imaging confocale.
Zebrafish (Danio rerio) sta emergendo come un potente organismo modello di vertebrato per studiare lo sviluppo e le malattie. Zebrafish condivide caratteristiche genetiche altamente conservate (~70% omologia genetica e ~84% geni correlati alle malattie) e caratteristiche morfologiche di base degli organicon l’uomo 1,2. Questa conservazione consente l’uso di zebrafish per modellare diverse malattie umane, tra cui ilcancro 3,4.
La manipolazione e la manutenzione del pesce zebra è molto più facile ed economica rispetto ai topi a causa delle loro piccole dimensioni, dell’elevata fecondità tutto l’anno e della fecondazioneesterna 3,5. Gli embrioni di zebrafish non richiedono un’alimentazione dal vivo durante i loro primi 5-7 giorni di vita e sono stati utilizzati come modello efficace per lo sviluppo, l’infezione eil cancro 1,4,6,7. Gli embrioni di zebrafish si schiudono a 48 ore dopo la fecondazione (HPF) e sono animali a nuoto libero con tutti gli organi formati, un cuore pulsante e un sistema circolatorio funzionale, fegato, cervello, midollo renale,ecc. 1,3. Inoltre, in questa fase di sviluppo è in gioco solo l’immunità innata, l’immunità adattiva è ancora in fase di sviluppo, consentendo un innesto generale ed efficiente delle cellule umane senza bisogno di utilizzare mutanti immunocompro compromessi7,8. Tuttavia, è importante notare che non tutte le cellule umane si innestoallo stesso modo 9 e che, ad esempio, per le cellule leucemie è stato dimostrato che i fagociti (neutrofili e macrofagi) devono essere esauriti per un efficiente innesto10.
La trattabilità genetica del pesce zebra e la trasparenza ottica dei suoi primi stadi embrionali consentono l’imaging intravitale a singola cellula ad alta risoluzione e quindi, per la creazione di tecniche di imaging all’avanguardia in diversi campi della biologia. Inoltre, nel contesto del cancro, queste caratteristiche sono utili per studi in tempo reale delle prime fasi delle interazioni ospite-tumore, come lo studio del potenziale angiogenico e metastatico, nonché delle interazioni con il sistema immunitario innato8,9,11,12,13.
Sebbene nel breve saggio xenograft non ci sia tempo per l'”evoluzione” metastatica- è possibile analizzare la capacità metastatica delle cellule tumorali (cioè la loro efficienza di passare attraverso passaggi metastatici come invasione, intravasazione, sopravvivenza in circolazione, estravasione e colonizzazione, e quindi studiare questi processi in vivo e in tempo reale8,11,13,14).
Le caratteristiche del suo ciclo vitale posizionare il pesce zebra come modello unico per la medicina personalizzata nel cancro. I saggi possono essere eseguiti in un arco di tempo più breve e i risultati ottenuti inpoche settimane 7,8,9,11,12,15,16. La sedano e la fattibilità di questi saggi offrono a medici e ricercatori la possibilità di ottenere risultati tras tras traslazione che possono essere utili per i pazienti oncologici, per i quali il tempo è un bisogno essenziale.
Nonostante i crescenti tentativi di generare xenografti embrionale zebrafish di successo, c’è ancora bisogno della standardizzazione della procedura di iniezione e della valutazione della vitalità cellulare e del comportamento tumorale dopo l’iniezione.
In questo protocollo forniamo ai ricercatori una guida dettagliata e chiara per l’iniezione di linee cellulari tumorali umane negli embrioni di zebrafish e la successiva fissazione, immunostaining, imaging e quantificazione del comportamento delle cellule tumorali.
La crescente importanza del pesce zebra come modello per lo sviluppo del cancro e lo screening farmacologico ha portato a numerosepubblicazioni 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Tuttavia, l’iniezione di cellule tumorali negli embrioni di zebrafish è una tecnica che richiede un alto livello di destrezza che può essere impegnativo per i ricercatori. In questo protocollo miriamo a fornire informazioni pratiche e alcuni suggerimenti che possono aiutare a superare le sfide iniziali della creazione di xenografti embrionale zebrafish.
Manipolazione cellulare prima dell’iniezione
Questo protocollo ottimizzato per la generazione di xenografti zebrafish con linee cellulari può essere adattato a vari tipi di cellule (tumorali) con morfologie diverse. Si consiglia che tutte le linee cellulari utilizzate per gli xenografti zebrafish siano senza micoplasma. A differenza di altre contaminazioni batteriche, la presenza di micoplasma nella coltura cellulare non genera cambiamenti che possono essere facilmente rilevati almicroscopio 22. La contaminazione da micoplasma può influenzare il potenziale di innesto delle linee cellulari, la loro sensibilità ai farmaci e la vitalità degli embrioni di zebrafish.
Sebbene le cellule possano continuare a proliferare per un periodo prolungato, il loro fenotipo e genotipo può essere soggetto a cambiamenti. È importante familiarizzare con la morfologia e il comportamento delle linee cellulari in coltura. Si consiglia di mantenere il numero di passaggi cellulari dopo lo scongelamento tra 3-12 per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, devono essere eseguiti regolari test del micoplasma.
Le cellule devono essere nella fase di log (fase di crescita esponenziale prima di raggiungere la confluenza ~70%) il giorno dell’iniezione. Ciò consentirà un adeguato innesto e un corretto sviluppo dei tratti distintivi del tumore. Per prevenire variazioni nel fenotipo delle cellule all’interno dello xenograft, è fondamentale mantenere la confluenza per la costante di iniezione tra gli esperimenti. Il numero di cellule iniettate può essere adattato alle caratteristiche di ogni linea cellulare in quanto alcune possono richiedere densità di iniezione più elevate per prosperare negli embrioni di zebrafish.
Considerazioni sull’etichettatura delle celle
Per visualizzare meglio le cellule tumorali umane per l’iniezione e l’analisi futura, le cellule tumorali possono essere etichettate con coloranti fluorescenti. A causa delle differenze nelle dimensioni cellulari, il numero totale di cellule /cm2 nelle colture aderenti varia tra le linee cellulari. Ciò influirà sull’efficacia del protocollo di colorazione e sul numero di cellule raccolte per iniezione. Le celle di grandi dimensioni che producono numeri bassi per pallone (cioè Hs578T) o crescono in cluster (ad esempio, BFTC905) richiederanno la messa in comune di diversi contenitori per un singolo esperimento. In questo caso, la colorazione delle cellule non dovrebbe essere eseguita direttamente nel pallone in quanto ciò causerà l’uso di quantità eccessive di colorante (costo elevato). D’altra parte, le cellule altamente sensibili ai cicli eccessivi di centrifugazione e quelle che producono numeri elevati per pallone (cioè HCT116) possono essere macchiate direttamente nel pallone e quindi staccate con EDTA /raschietto a celle (per ulteriori informazioni vedere tabella 1).
Quando possibile, invece di utilizzare un approccio enzimatico, utilizzare EDTA per staccare le cellule il giorno dell’iniezione, in modo che le cellule recuperino più rapidamente le loro giunzioni cellulare-cellulari e siano sottoposte a passaggi meno centrifugati. Tuttavia, se le cellule sono sensibili all’EDTA, molto aderenti o crescono in cluster – può essere applicato un metodo enzimatico. L’ottimizzazione della concentrazione ideale per iniezione e del mezzo di iniezione dipende dalle caratteristiche di ciascuna linea cellulare, per cui potrebbe essere necessario alcuni aggiustamenti(tabella 1).
Calibrazione della microiniezione
Contrariamente alla consegna di oligonucleotidi o farmaci nell’embrione zebrafish, un graticule non viene utilizzato per calibrare l’ago quando si lavora con linee cellulari per xenografti. Dopo un po ‘di tempo durante l’iniezione, le cellule inizieranno a intasarsi ed è necessario tagliare la punta dell’ago per aumentarne il diametro o cambiare del tutto l’ago. Questa procedura ostacola la calibrazione del graticolato.
Per risolvere questo problema, il numero di cellule erose è regolato dalla pressione di espulsione e dal tempo necessario per raggiungere una dimensione simile all’occhio dell’embrione entro 1-3 impulsi. Quindi, per controllare ulteriormente la dimensione del tumore, a 1 dpi, gli xenoinnesti vengono ordinati in base alla dimensione tumorale come mostrato nella figura 6 B-B”. Come rappresentato nell’esempio della figura 6C, questo metodo di ordinamento è efficiente nel ridurre la variazione delle dimensioni del tumore: se le uniamo tutte insieme (+, ++, +++) la STEV è ~double della classe ++(~906 cellule a ~422 cellule) e la variazione del coefficiente è di ~31,9% rispetto al 14,5% della classe ++. Poiché il riferimento per l’iniezione è il volume, il numero totale di cellule varia molto tra i tipi di cella, dipendendo dalle dimensioni e dalla forma delle cellule. Ad esempio, le grandi cellule con un sacco di citoplasma come il cancro al seno Hs578T, producono tumori molto più piccoli (~ 600 cellule). Inoltre, ogni riga di cella richiede un numero diverso di celle. Ad esempio, le linee cellulari di cellule tumorali della vescica urinaria HT29 CRC e RT112 hanno dimostrato che maggiore è il numero di cellule iniettate, maggiore è la mortalità dei pesci zebra. Pertanto, è necessario un periodo di ottimizzazione durante lo sviluppo degli xenoinnesti per verificare se la linea cellulare ha effetti tossici nell’embrione o richiede densità di iniezione più elevate / inferiori.
Sito di iniezione
Una delle discrepanze più comuni quando si generano xenografti di embrioni di zebrafish è il sito di iniezione. Il tuorlo è di solito il luogo di scelta per l’iniezione grazie alla sua facile accessibilità. Tuttavia, abbiamo osservato che le cellule iniettate nel tuorlo hanno una maggiore tendenza a morire. Anche se tecnicamente più difficile, si consiglia di iniettare nel PVS e il più lontano possibile dal cuore. All’interno del PVS, le cellule possono aggregare, reclutare vasi e cellule immunitarie e migrare, intravascolarizzare, estrapolare e formare micrometastasi, se mostrano caratteristiche metastatiche8,11.
Efficienza di innesto
Le differenze nell’efficienza di innesto e nella dimensione del tumore tra le linee cellulari a 4 dpi sono previste a causa dei loro distinti gradi di morte /sopravvivenza / proliferazione delle cellule basali, ma anche a causa dell’immunogenicità innata che ogni linea cellulare puòmostrare 9.
metastasi
La metastasi comprende una cascata multistep di eventi che possono essere divisi in due stadi arbitrari. Nella prima fase, le cellule tumorali devono staccarsi dal sito primario, migrare e invadere i tessuti adiacenti e poi intravascolarizzarsi nel flusso sanguigno. Nel secondo stadio, le cellule tumorali devono sopravvivere in circolazione, estrapolare dal sangue o dai vasi linfatici e infine colonizzare nei siti secondari23. Per distinguere tra questi eventi precominali e tardive e affrontare il potenziale / competenza delle diverse cellule tumorali per eseguire questi passaggi, abbiamo progettato un semplice test.
In generale, quando iniettate nel PVS, le cellule tumorali possono entrare direttamente in circolazione e quindi rimanere fisicamente intrappolate nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) (regione della coda). Tuttavia, in base alle caratteristiche di ogni cellula tumorale – abbiamo visto che alcune cellule tumorali rimangono al CHT 4 dpi e sono in grado di formare micrometastasi mentre altre cellule tumorali scompaiono (cancellate dopo essere state catturate nella CHT).
Pertanto, confrontando l’efficienza della micrometastasi (a 4 dpi) quando le cellule sono state poste direttamente in circolazione – CIRC (le cellule devono solo passare attraverso i passaggi tardivi della metastasi) rispetto a quando no – NO CIRC (le cellule devono passare attraverso passaggi precoci e tardivi per essere in grado di formare una micrometastasi) possiamo valutare il loro potenziale metastatico precoce o tardivo. Abbiamo osservato cellule tumorali che possono formare efficacemente micrometastasi nella CHT in entrambi i gruppi (CIRC e NO CIRC), suggerendo che queste cellule hanno la capacità di subire tutti i passaggi della cascata metastatica (SW480 e MDA-MB-468 per esempio)8,11. Al contrario, altre cellule tumorali hanno un potenziale metastatico molto basso in entrambi i gruppi, quasi mai facendo micrometastasi, anche se iniettate in circolazione (cioè, visibili nella CHT a 24 hpi, ma a 4 dpi non ci sono più, Hs578T peresempio) 8. Tuttavia, abbiamo chiaramente trovato un altro gruppo – uno che è in grado di formare micrometastasi solo quando iniettato in circolazione (possiamo osservare solo la micrometastasi nel gruppo CIRC). Ciò suggerisce che queste cellule hanno una bassa efficienza nell’eseguire i primi passi della cascata metastatica ma d’altra parte sono in grado di sopravvivere in circolazione, estrapolare e colonizzare un sito lontano.
Immunostaining e imaging
Prima della fissazione, questo protocollo di iniezione può essere utilizzato per altri approcci di imaging dal vivo come microscopia DIC (Live Differential Interference Contrast), microscopia a disco rotante, imaging confocale vivo ad alta risoluzione e microscopia a fogli luminosi, ecc.
Le cellule morte e i detriti cellulari appaiono luminosi se osservati attraverso lo stereomicroscopio fluorescente e possono essere scambiati per cellule vive, specialmente se lo scopo dello studio è valutare il potenziale metastatico delle linee cellulari. Vorremmo sottolineare l’importanza di eseguire l’imaging confocale con specifici marcatori di vitalità e DAPI per valutare lo stato di sopravvivenza del tumore e della micrometastasi. Inoltre, è fondamentale utilizzare anticorpi umani specifici per rilevare cellule umane come i mitocondri anti-umani o l’HLA anti-umano. Quando si implementa il protocollo, addestrare gli occhi dello sperimentatore confrontando la colorazione nello stereomicroscopio con le immagini confocali. Dopo un po ‘di tempo, gli sperimentatori possono distinguere chiaramente i detriti dalle cellule vive nello stereomicroscopio fluorescente.
Sebbene altri metodi per quantificare il carico tumorale come l’intera area di fluorescenza siano ampiamente utilizzati, si consiglia di eseguire l’immunostaining a montaggio intero e l’imaging confocale come metodo più accurato. Non solo l’efficienza della colorazione dei coloranti lipofili è molto variabile (cioè, alcune cellule sono molto ben macchiate mentre altre non sono – probabilmente a causa del contenuto lipidico delle loro membrane), ma anche molte volte i coloranti lipofili formano aggregati e le cellule morte tendono ad essere più luminose – creando diversi artefatti che possono essere scambiati per cellule vive.
Le cellule possono essere trasdotto con proteine fluorescenti per aiutare nel loro tracciamento e saltare l’etichettatura cellulare. Tuttavia, assicurarsi che le cellule trasdutte e non trasdutte producano gli stessi risultati negli xenografti zebrafish.
Inoltre, i macrofagi possono fagocitare questi detriti cellulari fluorescenti diventando marcati fluorescentmente e migrano, generando false cellule metastatiche positive. Pertanto, raccomandiamo una serie di strumenti analitici, che ovviamente possono essere estesi a molte altre letture per un’interpretazione più accurata del comportamento tumorale:
Per un’acquisizione confocale con intervallo di 5 μm tra fette nella pila Z delle cellule tumorali di controllo HCT116 (dimensione nucleare media di 10-12 μm di diametro) con controsottenimento DAPI, abbiamo osservato che ~50% delle cellule sono condivise tra due fette consecutive. Pertanto, se ogni fetta viene conteggiata, c’è un alto rischio di contare le stesse celle due volte. Andare avanti e indietro tra una sezione e l’altra per evitare problemi di quantificazione si traduce in una tecnica che richiede tempo e soggetta a errori. Per facilitare la quantificazione del numero totale di cellule e consentire una maggiore riproducibilità tra i ricercatori, abbiamo creato la formula delle dimensioni tumorali precedentemente descritta in questo protocollo8.
Abbiamo incluso un numero di correzione (1.5) per tenere conto delle celle ~50% condivise tra le sezioni. Abbiamo scoperto che l’errore medio del conteggio manuale dell’intero tumore tra i ricercatori era del 20%. Due ricercatori che hanno usato la formula hanno avuto un errore del 2%. L’uso di questa formula ha un tasso di precisione del 93% e un tasso di riproducibilità del 98%. Abbiamo anche testato metodi automatizzati, ma hanno dimostrato un errore superiore al 50% causato dalle impostazioni di soglia.
A causa delle caratteristiche delle cellule apoptotiche, la quantificazione delle cellule Caspasi 3 attivate è più difficile. Per ridurre il numero di errori e variazioni nei risultati, si consiglia di contare il controllo e i campioni sperimentali dallo stesso ricercatore. Inoltre, quando si impara questa tecnica, un nuovo ricercatore deve contare immagini che erano già state quantificate da ricercatori più esperti per confrontare i risultati e allenarsi.
La lunghezza del saggio può essere estesa se necessario. Tuttavia, è importante considerare che le larve di zebrafish richiedono un’alimentazione viva a partire da ~ 7 giorni dopo la fecondazione (5 giorni dopo l’iniezione). Inoltre, le linee guida e i regolamenti sul benessere degli animali applicati alle larve di età superiore a 6 giorni dopo la fecondazione possono variare.
Questo protocollo fornisce strumenti utili per consentire a un singolo ricercatore di iniettare circa ~ 200-300 larve di zebrafish all’ora; e i risultati per il saggio completo, compresa l’analisi e l’interpretazione statistica, ottenuti in tre settimane. Speriamo che questo protocollo possa aiutare i ricercatori a diventare esperti nella generazione di xenografti zebrafish. Non è facile; devi esercitarti ma ci arrivarai. Buona Fortuna!
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo fondazione Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanziata da FCT/Lisboa2020) per il finanziamento. Borse FCT per VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Tutti i membri del Fior Lab per le discussioni critiche; B. Costa e C. Rebelo de Almeida per la condivisione dei dati; e i nostri membri del laboratorio C. Rebelo de Almeida, M. Barroso e L. Leite per la loro partecipazione al video. Ringraziamo il team CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) e Champalimaud Communication, Events and Outreach team in particolare Alexandre Azinheira per il fantastico cinema e Catarina Ramos e Teresa Fernandes per il loro aiuto.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |