Questo protocollo descrive l’uso di una tecnica ecografica avanzata per osservare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti del tessuto epatico nei modelli di roditori di steatosi epatica non alcolica.
La steatoepatite non alcolica (NASH) è una condizione all’interno dello spettro della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che è caratterizzata da accumulo di grasso epatico (steatosi) e infiammazione che porta alla fibrosi. I modelli preclinici che ricapitolano strettamente la NASH/NAFLD umana sono essenziali nello sviluppo di farmaci. Mentre la biopsia epatica è attualmente il gold standard per misurare la progressione e la diagnosi di NAFLD / NASH in clinica, nello spazio preclinico, è necessaria la raccolta di campioni di fegato intero in più punti temporali durante uno studio o la biopsia del fegato per l’analisi istologica per valutare lo stadio della malattia.
Condurre una biopsia epatica a metà studio è una procedura invasiva e laboriosa e la raccolta di campioni di fegato per valutare il livello di malattia aumenta il numero di animali da ricerca necessari per uno studio. Pertanto, vi è la necessità di un biomarcatore di imaging affidabile, traducibile e non invasivo per rilevare NASH / NAFLD in questi modelli preclinici. Le immagini B-mode basate su ultrasuoni non invasive e l’elastografia a onde di taglio (SWE) possono essere utilizzate per misurare la steatosi e la fibrosi epatica. Per valutare l’utilità della SWE nei modelli preclinici di NASH di roditori, gli animali sono stati sottoposti a una dieta pro-NASH e sottoposti a ecografia non invasiva in modalità B e ecografia ad onda di taglio per misurare l’indice epatorenale (HR) e l’elasticità epatica, misurando la progressione sia dell’accumulo di grasso epatico che della rigidità dei tessuti, rispettivamente, in più punti temporali nel corso di un determinato studio NAFLD / NASH.
L’indice HR e i numeri di elasticità sono stati confrontati con i marcatori istologici di steatosi e fibrosi. I risultati hanno mostrato una forte correlazione tra l’indice HR e la percentuale di colorazione Oil Red O (ORO), nonché tra elasticità e colorazione picro-sirio red (PSR) del fegato. La forte correlazione tra i metodi classici ex vivo e i risultati dell’imaging in vivo fornisce la prova che l’elastografia a onde di taglio / imaging basato su ultrasuoni può essere utilizzata per valutare il fenotipo e la progressione della malattia in un modello preclinico di NAFLD / NASH.
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è una condizione metabolica caratterizzata da un eccessivo accumulo di grasso nel fegato e sta rapidamente diventando un disturbo epatico leader in tutto il mondo con una prevalenza globale recentemente riportata del 25%1. La steatoepatite non alcolica (NASH) è uno stadio più avanzato dello spettro della NAFLD, caratterizzato da eccesso di grasso epatico con danno cellulare progressivo, infiammazione e fibrosi. Questi disturbi sono spesso silenziosi, inosservati attraverso esami del sangue o esami di routine, fino a quando non si è già verificato un danno considerevole al fegato di un paziente. Attualmente, il gold standard per diagnosticare la NASH nei pazienti è attraverso l’esame istologico di campioni di biopsia epatica derivati dal paziente. Allo stesso modo, i ricercatori preclinici che lavorano per comprendere la patogenesi della NASH / NAFLD e l’industria dello sviluppo di farmaci si affidano alla biopsia a cuneo in vivo di campioni di fegato o all’eutanasia terminale di coorti satellite per l’istologia per misurare steatosi, infiammazione e fibrosi.
Ad esempio, la biopsia del cuneo epatico è stata una tecnica standard per valutare la steatoepatite e la fibrosi durante l’utilizzo del modello GUBRA NASH2. Il metodo di biopsia del cuneo epatico è invasivo e laborioso nei piccoli animali3. L’uso della biopsia epatica a cuneo nel mezzo di uno studio rappresenta una variabile sperimentale aggiuntiva in un modello di malattia, che spesso aumenta il numero di animali necessari. Con questi fattori in mente, le tecniche di imaging non invasive che possono essere utilizzate per valutare in modo affidabile la steatosi e la fibrosi in modelli animali NASH / NAFLD nei primi momenti si rivelano preziose. L’elastografia ad onde di taglio (SWE) è un metodo basato su ultrasuoni utilizzato per misurare l’elasticità dei tessuti molli. La tecnica misura la propagazione delle onde di taglio create da impulsi ultrasonici supersonici diretti a un bersaglio tissutale, e quindi calcola un valore chiamato modulo E4. La velocità dell’onda di taglio è proporzionale al grado di rigidità del tessuto.
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano la configurazione dell’area di imaging e lo strumento SWE. Lo strumento SWE è un’unità singola con ruote con due schermi e un pannello di controllo mostrato nella Figura 2A. Il monitor superiore (Figura 2B) funge da monitor del computer e visualizza immagini e directory dei pazienti. Il pannello di controllo (Figura 2C) è una serie di pulsanti e quadranti che controllano gli aspetti generali dell’acquisizione delle immagini: congelamento dello schermo, salvataggio delle immagini, passaggio da una modalità all’altra. Lo schermo inferiore (Figura 2D) è un touch screen con controlli aggiuntivi per modificare le impostazioni e funge da tastiera per inserire i dati in base alle esigenze. Lo strumento è dotato di uno stilo da utilizzare sul touch screen se lo si desidera. Le sonde ad ultrasuoni si attaccano al pannello frontale inferiore del dispositivo. Per l’imaging in modalità B e SWE nei roditori, è stato utilizzato il trasduttore super-lineare da 6 a 20 MHz. Questa capacità di misurare in modo non invasivo la rigidità dei tessuti rende la SWE uno strumento prezioso per l’identificazione e la stadiazione della fibrosiepatica 5 nei pazienti con NASH, diminuendo la necessità di metodi più invasivi. SWE è, infatti, stato utilizzato per misurare la fibrosi epatica nei pazienti ed è un metodo approvato dalla FDA per segnare la fibrosi nella clinica6. L’uso di SWE per monitorare la progressione della NASH in modelli animali della malattia fornirebbe uno strumento traslazionale per lo sviluppo di trattamenti e contemporaneamente migliorerebbe il benessere degli animali attraverso la riduzione del numero di soggetti animali e il perfezionamento delle procedure in vivo per ridurre al minimo il dolore e l’angoscia.
L’imaging SWE nei pazienti umani utilizza un trasduttore ad ultrasuoni a bassa frequenza4, che non è l’ideale per i piccoli animali. In particolare, sono state utilizzate tecniche SWE ad alta frequenza per valutare l’efficacia dell’inibizione dell’acetil-CoA carbossilasi sulla patogenesi della NASH in un modello di ratto7e l’utilità di questa tecnica è stata descritta in modelli di ratto tetracloruro di carbonio di fibrosi epatica con risultati positivi rispetto ai tradizionali metodi di punteggio istologico METAVIR8. Tuttavia, la letteratura esistente manca di informazioni tecniche e metodologiche dettagliate sull’applicazione dell’imaging SWE in modelli preclinici di NASH. Come descritto sopra, la steatosi epatica è una delle caratteristiche chiave della condizione NAFLD / NASH ed è una fase importante in cui può essere considerato l’intervento. Pertanto, valutare l’accumulo di grasso epatico utilizzando una modalità di imaging è importante quanto valutare la fibrosi epatica in modelli preclinici di NASH / NAFLD.
Una tecnica ecografica nota come indice HR, un rapporto di luminosità tissutale del fegato rispetto a quella della corteccia renale, è stata utilizzata come marcatore surrogato della steatosi nella clinica9,10. Questo approccio, tuttavia, non è stato ampiamente utilizzato nei modelli animali preclinici di NAFLD/NASH. Questo articolo descrive un metodo per misurare l’elasticità e l’indice HR come marcatore surrogato della fibrosi epatica e della steatosi, rispettivamente, in un modello di ratto con dieta ad alto contenuto di colina e ad alto contenuto di grassi (CDAHFD) di NAFLD / NASH. Questo modello induce steatosi rapida, infiammazione del fegato e fibrosi, che è misurabile entro 6 settimane nei topi11. L’aggiunta di colesterolo (1%) a questa dieta ha dimostrato di promuovere la fibrogenesi nei ratti12, rendendo questo modello un candidato adatto per studi di convalida che coinvolgono l’imaging delle onde di taglio. Nel complesso, questa tecnologia di imaging può anche essere applicata a una vasta gamma di modelli / diete NASH in cui la steatosi e / o la fibrosi sono un endpoint di interesse.
L’imaging basato su ultrasuoni, inclusa la SWE, può essere uno strumento inestimabile per la valutazione longitudinale della steatosi epatica e della rigidità nei modelli preclinici di NAFLD / NASH. Questo documento descrive metodologie dettagliate su come acquisire immagini di alta qualità B-mode e SWE di fegati per la misurazione dell’indice HR e dell’elasticità utilizzando un modello di NASH indotto dalla dieta CDAHFD. Inoltre, i risultati mostrano un’eccellente correlazione dell’indice HR e dell’elasticità con i…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il team operativo di medicina comparativa di Pfizer per il loro duro lavoro di cura e garanzia della salute degli animali in studio, nonché per l’assistenza con alcune delle tecniche. Inoltre, i ringraziamenti sono dovuti a Danielle Crowell, Gary Seitis e Jennifer Ashley Olson per il loro aiuto con l’elaborazione dei tessuti per le analisi istologiche. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Julita Ramirez per aver esaminato e fornito preziosi feedback durante la preparazione di questo manoscritto.
Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
Alpha-dri bedding | rat cages | ||
Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
Purina | 5053 | Control animal chow | |
Wistar Han rats | Charles River Laboratories |