Summary

Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Published: May 11, 2021
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Summary

Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).

Abstract

La bioprinting tridimensionale (3D) utilizza compositi a base di idrogel (o inchiostri di biomateriali) che si depositano in un modello, formando un substrato su cui vengono depositate le cellule. Poiché molti inchiostri di biomateriali possono essere potenzialmente citotossici per le cellule primarie, è necessario determinare la biocompatibilità di questi compositi idrogel prima del loro utilizzo in costosi processi di ingegneria tissutale 3D. Alcuni metodi di coltura 3D, tra cui il bioprinting, richiedono che le cellule siano incorporate in una matrice 3D, rendendo difficile estrarre e analizzare le cellule per i cambiamenti nella vitalità e nell’espressione dei biomarcatori senza provocare danni meccanici. Questo protocollo descrive come prova di concetto, un metodo per valutare la biocompatibilità di un composito di agarosio incorporato nella nanocellulosa cristallina (CNC), fabbricato in un sistema di coltura a 24 pozzetti, con mastociti derivati dal midollo osseo di topo (BMMC) utilizzando saggi citometrici a flusso per la vitalità cellulare e l’espressione di biomarcatori.

Dopo 18 ore di esposizione alla matrice CNC/agarosio/D-mannitolo, la vitalità del BMMC è rimasta inalterata misurata dalla permeabilità allo ioduro di propidio (PI). Tuttavia, le BMMC coltivate sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembravano aumentare leggermente la loro espressione del recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) e del recettore del fattore delle cellule staminali (Kit; CD117), anche se questo non sembra dipendere dalla quantità di CNC nel composito bioink. La fattibilità dei BMMC è stata anche valutata a seguito di un’esposizione a intervalli di idrogel fabbricati da un inchiostro di biomateriale commerciale composto da nanocellulosa fibrillare (FNC) e alginato di sodio utilizzando un bioprinter di estrusione 3D. Per un periodo di 6-48 ore, i substrati FNC/alginato non hanno influenzato negativamente la vitalità delle BMMC come determinato mediante citometria a flusso e saggi di microtitolazione (XTT e lattato deidrogenasi). Questo protocollo descrive un metodo efficiente per esaminare rapidamente la compatibilità biochimica degli inchiostri biomateriali candidati per la loro utilità come scaffold 3D per la semina post-stampa con i mastociti.

Introduction

Il recente interesse per i sistemi di coltura 3D e il bioprinting 3D ha focalizzato l’attenzione su idrogel e compositi idrogel. Questi compositi fungono da biomimetica viscosa ma porosa e possono essere composti fino al 99% di contenuto di acqua in peso, che è paragonabile ai tessuti biologici1,2,3. Queste caratteristiche dei compositi idrogel consentono quindi la crescita delle cellule senza influire sulla loro vitalità e funzione. Uno di questi compositi è la nanocellulosa cristallina (CNC), che è stata utilizzata come materiale di rinforzo nei compositi idrogel, negli scaffold cellulari nello sviluppo di impianti di biomateriali e nelle colture cellulari bidimensionali (2D) e 3D di vitro4,5. Per la maggior parte, le matrici composte da CNC non sono apertamente citotossiche per le cellule epiteliali corneali umane6, le cellule epiteliali intestinali7, le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano8 o le cellule neuronali9. Tuttavia, l’attività metabolica e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano diminuiscono in correlazione con l’aumento della viscosità dei compositi nanocellulosici a base di legno, suggerendo che la composizione della matrice deve essere attentamente testata per i suoi effetti deleteri sulle funzioni cellulari8.

Allo stesso modo, il CNC può indurre risposte infiammatorie nei macrofagi dopo l’internalizzazione, che potrebbero avere gravi conseguenze nei sistemi di coltura cellulare immunitaria 3D10,11. In effetti, ci sono pochissimi dati disponibili su come il CNC può influenzare altre risposte delle cellule immunitarie, in particolare le risposte infiammatorie allergiche che vengono avviate dai mastociti. I mastociti sono leucociti granulati che esprimono il recettore delle IgE ad alta affinità, FceRI, responsabile dell’attivazione delle risposte infiammatorie agli allergeni. La loro proliferazione e differenziazione dipendono dal fattore delle cellule staminali (SCF), che lega il recettore della tirosina, Kit. I mastociti sono derivati da cellule progenitrici del midollo osseo che entrano in circolazione e successivamente migrano perifericamente per disperdersi ubiquitariamente in tutti i tessuti umani12. Poiché i mastociti funzionano in un ambiente tissutale 3D, sono un candidato immunocellulare ideale per lo studio dei processi immunologici in modelli tissutali 3D in vitro. Tuttavia, ad oggi, non esiste un modello di tessuto 3D in vitro praticabile contenente mastociti.

A causa della natura altamente sensibile dei mastociti e della loro propensione a suscitare risposte pro-infiammatorie a stimoli esterni, è necessaria un’attenta considerazione dei costituenti della matrice 3D e del metodo di bioprinting per introdurre i mastociti nello scaffold 3D, come discusso ulteriormente. I costrutti tissutali possono essere biofabbricati da due grandi categorie di biomateriali, vale a dire, bioink e inchiostri biomateriali. La distinzione sta nel fatto che i bioink sono compositi di idrogel carichi di cellule, mentre gli inchiostri di biomateriali sono compositi di idrogel privi di cellule, come definito da Groll et al.13,14. Quindi, i costrutti 3D stampati con bioink contengono cellule pre-incorporate all’interno della matrice idrogel, mentre i costrutti 3D stampati con inchiostri biomateriali devono essere seminati con cellule post-stampa. La biofabbricazione di scaffold di coltura da bioink / inchiostri biomateriali a base di idrogel viene eseguita più comunemente utilizzando bioprinter 3D di estrusione, che estrudono l’inchiostro bioink / biomateriale attraverso un ugello su microscala sotto pressione tramite un pistone pneumatico o meccanico14. Le biostampanti di estrusione fabbricano scaffold 3D depositando il bioink in modelli di sezione trasversale 2D che sono impilati sequenzialmente l’uno sull’altro in un approccio “bottom-up”.

Per essere compatibile con la bioprinting per estrusione, l’inchiostro bioink/biomateriale a base di idrogel deve possedere proprietà tissotropiche (diradamento del taglio), per cui i polimeri idrogel costituenti dell’inchiostro bioink/biomateriale fluiscono come un fluido attraverso un ugello a microcanale quando sottoposti a sforzo di taglio, ma ritornano a uno stato viscoso e gelatinoso dopo la rimozione dello stress di taglio15 . A causa del loro elevato contenuto di acqua, i polimeri di bioink a base di idrogel / inchiostri biomateriali devono essere reticolati, fisicamente o covalentemente, per mantenere l’architettura e l’integrità strutturale della struttura biostampata 3D. Nel caso di bioink carichi di cellule, le cellule sono direttamente sottoposte a sollecitazioni chimiche durante il processo di reticolazione. Il processo di estrusione delle cellule incapsulate all’interno della matrice di idrogel bioink sottopone anche le cellule a stress di taglio, che può portare a una ridotta vitalità e / o morte cellulare. Una volta che il modello tissutale 3D è stato biostampato, è difficile discriminare tra i livelli di citotossicità suscitati dalla matrice idrogel stessa e i processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di scaffold 3D in cui le cellule sono pre-incorporate all’interno della matrice di idrogel, rendendo così difficile rimuovere le cellule per le analisi successive, il che sarebbe dannoso per la vitalità dei mastociti.

Un approccio più delicato alla generazione di costrutti tissutali 3D contenenti mastociti comporta la semina delle cellule in scaffold 3D a inchiostro biomateriale poroso prestampato da una sospensione di coltura cellulare, che sfrutta la capacità innata dei mastociti di migrare dalla circolazione ai tessuti periferici. I vantaggi di questo approccio di semina cellulare sono duplici: (i) i mastociti non sono sottoposti a sollecitazioni di taglio e chimiche dai processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente, e (ii) le cellule possono essere facilmente rimosse dall’impalcatura 3D dopo l’esposizione mediante lavaggio delicato per l’analisi senza influire negativamente sulla loro vitalità. L’ulteriore vantaggio di seminare e analizzare la vitalità cellulare dei mastociti su scaffold di idrogel porosi biostampati in 3D rispetto ai dischi di idrogel 2D è che gli scaffold di idrogel biostampati in 3D ricapitolano le caratteristiche topografiche su microscala dei tessuti in vivo , che non sono presenti nei dischi idrogel planari 2D alla rinfusa. Questo approccio è un approccio adatto, rapido ed economico per determinare gli effetti citotossici potenzialmente catastrofici delle matrici di idrogel bioink candidate sui mastociti, così come su altre cellule immunologiche, prima di investire in costosi esperimenti di ingegneria tissutale 3D.

Protocol

NOTA: Questo protocollo è composto da cinque sezioni: (1) isolamento del midollo osseo di topo e differenziazione dei mastociti derivati dal midollo osseo del topo (BMMC), (2) fabbricazione di substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo in un sistema a 24 pozzetti e coltura di BMMC sui substrati, (3) rimozione di BMMC dai substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo e analisi della vitalità e dell’espressione del biomarcatore mediante citometria a flusso, (4) Bioprinting 3D di scaffold di idrogel da un inchiostro d…

Representative Results

Una delle caratteristiche più cruciali di un inchiostro biomateriale di successo o di un substrato di coltura è quella della biocompatibilità. In primo luogo, il substrato non deve indurre la morte cellulare. Esistono diversi metodi citometrici a microtitolazione e a flusso per quantificare la vitalità cellulare e la necrosi; tuttavia, questi metodi non sono suscettibili di analizzare le cellule incorporate all’interno di una matrice di idrogel. In questo protocollo, la limitazione di cui sopra viene aggirata seminan…

Discussion

La fabbricazione di tessuti biomimetici 3D richiede la riuscita fusione del bioink, che imita i componenti della matrice extracellulare, con i componenti cellulari per creare analoghi fisiologici dei tessuti in vivo . Ciò richiede l’uso di cellule primarie, e non di cellule trasformate, quando si fabbricano tessuti biomimetici fisiologici. Le cellule immunologiche primarie, come i mastociti, tuttavia, sono particolarmente suscettibili agli effetti citotossici e ai cambiamenti fenotipici che possono essere provo…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Alberta Innovates per aver fornito il CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho per la loro consulenza tecnica durante la preparazione della matrice CNC / agarosio / D-mannitolo. Ringraziamo anche Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides per la loro consulenza tecnica e supporto con la configurazione e la calibrazione della bioprinter 3D INKREDIBLE+.

Materials

A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

Riferimenti

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).

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Citazione di questo articolo
Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

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