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Research Article
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Il modello murino di disperazione cronica (CDM) della depressione consiste in sessioni di nuoto forzate ripetitive e un'altra fase di nuoto ritardata come lettura. Rappresenta un modello idoneo per l'induzione di uno stato depressivo cronico stabile per almeno 4 settimane, modificabile per valutare interventi di trattamento subcronico e acuto.
Il disturbo depressivo maggiore è una delle forme più diffuse di malattie mentali e causa enormi sofferenze individuali e oneri socioeconomici. Nonostante la sua importanza, l'attuale trattamento farmacologico è limitato e sono urgentemente necessarie nuove opzioni di trattamento. Un fattore chiave nella ricerca di potenziali nuovi farmaci è la valutazione della loro potenza antidepressiva in modelli animali appropriati. Il classico test di nuoto forzato di Porsolt è stato utilizzato a questo scopo per decenni per indurre e valutare uno stato depressivo. Consiste in due brevi periodi di nuoto forzato: il primo per indurre uno stato di depressione e il secondo il giorno successivo per valutare l'effetto antidepressivo dell'agente somministrato tra le due sessioni di nuoto. Questo modello potrebbe essere adatto come strumento di screening per potenziali agenti antidepressivi, ma ignora l'insorgenza ritardata dell'azione di molti antidepressivi. Il CDM è stato recentemente istituito e rappresentava una modifica del test classico con notevoli differenze. I topi sono costretti a nuotare per 5 giorni consecutivi, seguendo l'idea che negli esseri umani la depressione è indotta da stress cronico piuttosto che acuto. In un periodo di riposo di diversi giorni (1-3 settimane), gli animali sviluppano una disperazione comportamentale sostenuta. Il metodo di lettura standard è la misurazione del tempo di immobilità in un'ulteriore sessione di nuoto ritardata, ma vengono proposti diversi metodi alternativi per ottenere una visione più ampia dello stato d'animo dell'animale. È possibile utilizzare più strumenti di analisi per i cambiamenti comportamentali, molecolari ed elettrofisiologici. Il fenotipo depresso è stabile per almeno 4 settimane, fornendo una finestra temporale per strategie di trattamento antidepressivo rapide ma anche subcroniche. Inoltre, le alterazioni nello sviluppo di uno stato depressivo possono essere affrontate utilizzando questo approccio. Il CDM, quindi, rappresenta uno strumento utile per comprendere meglio la depressione e per sviluppare nuovi interventi terapeutici.
I disturbi affettivi, come il disturbo depressivo maggiore, sono tra le malattie mentali più frequenti e impegnative e sono associati a un'elevata sofferenza individuale1, ad un aumento del rischio di suicidio2 e causano un notevole onere socioeconomico3 per la società. Nonostante il suo impatto, le opzioni di trattamento sono limitate e vi è un urgente bisogno di sviluppare nuovi interventi antidepressivi, soprattutto a causa della crisi di innovazione in psicofarmacologia negli ultimi decenni. Per comprendere la fisiopatologia della depressione e testare potenziali nuovi agenti, sono urgentemente necessari modelli animali razionali e validi4. Per quasi mezzo secolo, il classico test di nuoto forzato (FST), originariamente descritto da Porsolt5, è stato utilizzato come induzione e lettura per lo screening di potenziali nuovi antidepressivi. Consiste in un periodo di nuoto forzato per 5-15 minuti il giorno 1, successiva applicazione di farmaci una tantum e valutazione della porzione che i topi trascorrono immobili in acqua in un altro periodo di nuoto il giorno successivo. Il tempo di immobilità è stato considerato come un comportamento di fuga naturale mancante e si pensava che fosse correlato al grado di uno stato simile alla depressione nei topi5.
Il FST classico è stato pesantemente criticato, non solo nella comunità scientifica6,7,8 ma anche nei media pubblici8. La maggior parte delle controversie intorno al FST sono dovute ai brevi periodi di induzione e trattamento di solo 1 giorno nel paradigma classico. È stato sostenuto che la FST rappresenta piuttosto un modello di trauma acuto che uno stato paragonabile alla depressione umana. Inoltre, il test porsolt potrebbe essere adatto come strumento di screening per potenziali agenti antidepressivi, ma ignora l'insorgenza ritardata dell'azione di molti antidepressivi.
Il modello di disperazione cronica (CDM)9,10,11,12,13,14,15, derivato dall'FST originale, rappresenta un modello animale più appropriato per la depressione. Nel CDM, lo stress da nuoto ripetuto per 5 giorni consecutivi evita effetti traumatici acuti. Non riuscendo a sfuggire a una situazione stressante ripetuta e continua, si pensa che i topi sviluppino uno stato di impotenza, resa e, infine, disperazione. Questo paradigma è più paragonabile alle attuali teorie psicologiche per lo sviluppo della depressione negli esseri umani rispetto a un singolo trauma acuto, che viene comunemente sperimentato all'inizio di un disturbo da stress post-traumatico. Lo stato depressivo risultante nella CDM è stabile fino a 4 settimane9 e quindi apre la possibilità di periodi di trattamento più lunghi, che sono meglio paragonabili alle condizioni cliniche, in cui gli antidepressivi di solito hanno bisogno di 2-4 settimane per mostrare un beneficio16.
La valutazione dello stato depressivo dovrebbe quindi essere multidimensionale. La misurazione del tempo di immobilità, come nel classico FST, è utile, ma non deve essere utilizzata come unico parametro di risultato. Vari metodi, che sono descritti di seguito, dovrebbero essere in grado di mappare diverse dimensioni di uno stato depressivo in linea con i sintomi che di solito si trovano negli esseri umani depressi. Adeguate valutazioni di lettura potrebbero includere il comportamento di fuga (tempo di immobilità9,10,17), il test di sospensione della coda (TST)9, l'anedonia (test di preferenza classico del saccarosio (SPT)18), il comportamento orientato alla motivazione (test di preferenza del saccarosio naso-poke (NPSPT)10), il comportamento di aspettativa/esplorazione (risposta al segnale ambiguo19; Test del labirinto a Y9), elettrofisiologia (misure di plasticità a lungo termine (potenziamento a lungo termine, LTP; depressione a lungo termine, LTD)20), valutazioni molecolari (modelli di attivazione di geni precoci immediati (IEG); ulteriori modelli di stress21).
Teoricamente, un test di nuoto ripetuto può essere utilizzato per indurre uno stato depresso senza alcuna valutazione del tempo di immobilità. Tuttavia, si raccomanda vivamente di fornire almeno una serie sperimentale proof-of-concept con tempi di immobilità. Inoltre, cdm rappresenta un modello adatto per valutare lo sviluppo di uno stato depressivo misurando il tempo di immobilità durante la fase di induzione. Specifici ceppi di topi o topi trattati prima del nuoto possono essere valutati in relazione alla resilienza o alla vulnerabilità allo stress e all'induzione della disperazione comportamentale.
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in accordo con le linee guida europee (UE 2010/63) e in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), l'ente nazionale per il benessere degli animali GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e sono stati approvati dal comitato per il benessere degli animali dell'Università di Friburgo e dal Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35), nonché le autorità locali. Entrambi i sessi di topi wild-type C57Bl6N di età compresa tra 10 e 14 settimane (70-98 giorni post-natali, PND) sono stati utilizzati per esperimenti wild-type (WT). Come linea resistente allo stress, è stata utilizzata la linea di topo transgenico con una maggiore espressione dei recettori dell'adenosina A1 sotto il promotore caMKII neuronale del proencefalo9,15. Dopo gli esperimenti, i topi sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale.
1. Preparazione
2. Fase di induzione
3. Valutazione di un trattamento antidepressivo
4. Valutazione dello sviluppo di uno stato depressivo
Nella prima sessione di nuoto della fase di induzione della CDM, i topi di solito mostrano un tempo medio di immobilità tra 190 s e 230 s, che aumenta costantemente con ogni sessione di nuoto aggiuntiva (Figura 1A). Questo aumento è più pronunciato nei primi 3 giorni e raggiunge una fase simile a un plateau negli ultimi 2-3 giorni. Il tempo di immobilità misurato il giorno 5 rimane stabile fino a 4 settimane, indicando una disperazione comportamentale stabile. La potenza antidepressiva di un intervento può essere valutata trattando l'animale tra l'ultimo giorno della fase di induzione e il giorno del test. Si noti che il tempo di punteggio assoluto durante le sessioni di nuoto è abbastanza soggettivo e dipende dallo sperimentatore, dall'età, dal sesso e dalla linea del mouse utilizzata. Tuttavia, la differenza relativa tra le sessioni è abbastanza stabile con solo piccole differenze interterrater.
Nella Figura 1, sono mostrati diversi trattamenti rappresentativi. L'imipramina, la privazione del sonno e la ketamina hanno ridotto significativamente il tempo di immobilità, mentre la privazione del sonno combinata con un sonno di recupero non ha mostrato un cambiamento significativo del fenotipo depressivo. Questi risultati sono concordanti con una potenza antidepressiva dei trattamenti applicati e simili agli effetti osservati nei pazienti umani. Il trattamento prevedeva l'ingestione di imipramina 20 mg/kg/die per 3 settimane tramite acqua potabile, 3 mg/kg di ketamina con una singola iniezione intraperitoneale 24 ore prima del test e privazione del sonno per 6 ore prima del test.
A seconda della domanda di ricerca, possono essere visualizzate varie rappresentazioni. Una rappresentazione di valori assoluti può fornire una reale panoramica dei dati e permette una buona valutazione della fase di induzione e di un singolo trattamento (Figura 1A,D). Tuttavia, le differenze dei vari trattamenti non possono essere confrontate direttamente; quindi ogni gruppo di trattamento ha diversi valori medi di immobilità-tempo il giorno 5. Pertanto, si consiglia di utilizzare la rappresentazione dei valori medi normalizzati in questo caso (Figura 1B). Una rappresentazione ridotta può essere scelta a causa di limiti di spazio (Figura 1C). Si noti che è obbligatorio mostrare almeno i risultati del giorno 1, del giorno 5 e del giorno del test.
Figura 1: Risultati positivi in valori assoluti e normalizzati. (A) Si può osservare un'induzione riuscita di uno stato simile a depresso in 30 topi. Ogni punto rappresenta il tempo di immobilità di un singolo animale in un giorno specifico e le barre rappresentano i valori medi degli animali testati. Il tempo di immobilità è rappresentato per ogni giorno della fase di induzione (dal giorno 1 al giorno 5) e per il giorno di prova (dopo la linea tratteggiata) con o senza trattamento. Si noti che in questo campione, un aumento significativo può essere osservato tra il giorno 1 e il giorno 2. In alcuni casi, i livelli di significatività vengono raggiunti per la prima volta tra il giorno 1 e il giorno 3. Per la continuazione dell'esperimento, è obbligatorio un aumento statisticamente significativo tra il giorno 1 e il giorno 5. Si noti l'effetto soffitto tipico (aumento tra i giorni 1, 2 e 3, rispetto alla differenza tra i giorni 4 e 5). Tra il giorno 5 e i giorni di prova, gli animali sono stati ospitati per 4 settimane nelle loro gabbie domestiche, senza ulteriore trattamento (CDM) o trattati con imipramina (Imip.); privazione del sonno (SD); privazione del sonno e sonno di recupero (RS) e ketamina (Ket). (B) Per ogni giorno viene indicato un tempo esemplare per le prestazioni dei singoli animali. (C) Rappresentazione normalizzata degli stessi risultati già mostrati nella Figura 1A. Il tempo di immobilità di ciascun animale e giorno è stato normalizzato al tempo di immobilità corrispondente il giorno 5 ed espresso in percentuale. I valori post-trattamento di diversi gruppi possono essere visualizzati e confrontati meglio utilizzando questo approccio. (D) Rappresentazione dei valori normalizzati per il giorno 1, il giorno 5 e il giorno del test (CDM). Dopo uno studio proof of concept di successo, i tempi di valutazione possono essere ridotti al primo giorno, al quinto giorno e al giorno del test. Questi punti temporali sono necessari perché è necessario un aumento significativo tra il giorno 1 e il giorno 5 per dimostrare un'induzione di successo e il giorno 5 deve essere confrontato con il giorno del test per fornire una dichiarazione sull'efficacia del trattamento. (E) Confronto del tempo di immobilità di tre diverse linee di topo: Wildtype (WT) mostra un'induzione riuscita; una linea resiliente esemplare (RL) mostra un comportamento simile alla depressione significativamente ridotto nei primi tre giorni e nel giorno del test. ANOVA unidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗/#p < 0,05, ∗∗/##p < 0,01, ∗∗∗/###p < 0,001, ∗∗∗∗/####p < 0,0001. (#indica la differenza ai valori medi del giorno 1, ∗indicare la differenza ai valori medi del giorno 5 nella Figura 1A,C e alla linea del mouse WT nella Figura 1E). I dati sono espressi come mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
In caso di un tempo di immobilità invariato durante tutti i 5 giorni (Figura 2), lo stress applicato non è stato in grado di modificare il comportamento in modo rilevante e non è possibile valutare gli effetti del trattamento; gli animali devono essere sacrificati e non devono essere utilizzati ulteriormente.
Figura 2: Risultati non riusciti. Una rappresentazione di un'induzione inefficace è mostrata nella figura. Si noti che non si verifica alcun aumento significativo del tempo di immobilità tra il giorno 1 e il giorno 5. Pertanto, i criteri per la continuazione dell'esperimento non sono stati raggiunti e nessun ulteriore prolungamento è razionale (in questo caso, sono stati testati solo topi maschi e, dopo un'indagine retrospettiva, è stato riscontrato che non erano compagni di cucciolata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ulteriori metodi di lettura devono essere utilizzati per descrivere una visione più ampia della disperazione comportamentale degli animali. Sono disponibili una varietà di test comportamentali, misurazioni elettrofisiologiche e valutazioni molecolari dei cambiamenti indotti dallo stress. Risultati esemplari per il Tail Suspension Test (TST), con trattamento CDM, imipramina e ketamina, Nose-poke-Sucrose Preference Test (NPSPT) e valutazione del potenziamento a lungo termine utilizzando la tecnica patch-clamp sono riportati nella Figura 3. Questi risultati incoraggiano l'utilizzo della fase di induzione CDM come strumento generale per l'induzione della disperazione comportamentale. Per ulteriori dettagli sulle tecniche utilizzate (TST, NPSPT, LTP-assessment) si veda 9,10,17,20.
Figura 3: Risultati aggiuntivi con mouse CDM. (A) Una rappresentazione esemplare degli effetti del CDM nella prova di sospensione della coda. I topi sono stati sospesi per la coda e il tempo trascorso immobile è stato registrato (per i dettagli metodologici si veda 9). Ogni punto rappresenta il tempo di immobilità di un singolo animale e le barre rappresentano i valori medi degli animali testati. ANOVA unidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗∗∗p < 0,001. I dati sono espressi come mezzi ± SEM. (B) Risultati rappresentativi del test di preferenza del saccarosio recentemente stabilito nei topi CDM. In questo compito, la preferenza per il saccarosio è stata misurata con uno sforzo gradualmente crescente per raggiungere la bottiglia di saccarosio (numero di nosepokes) (per i dettagli metodologici vedi10). Si noti che la preferenza per il saccarosio è diminuita nel CDM e che la differenza tra CDM e topi di controllo aumenta gradualmente con lo sforzo (valori medi di poke al naso ogni giorno indicato come Nspk1-7) che i topi hanno dovuto applicare per bere la soluzione dolce. ANOVA bidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001. I dati sono espressi come mezzi ± SEM. (C) I cambiamenti dipendenti dal CDM nella plasticità sinaptica a lungo termine sono presentati come cambiamenti dei valori medi degli EPSP dopo l'applicazione di un protocollo associativo di induzione LTP in fette di cervello ippocampale di topi WT. I dati sono stati ottenuti mediante stimolazione della sinapsi CA3-CA1 (per i dettagli vedere 17,20). I dati del t-test non accoppiato, ∗∗p < 0,01, sono espressi come mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tutti gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Il modello murino di disperazione cronica (CDM) della depressione consiste in sessioni di nuoto forzate ripetitive e un'altra fase di nuoto ritardata come lettura. Rappresenta un modello idoneo per l'induzione di uno stato depressivo cronico stabile per almeno 4 settimane, modificabile per valutare interventi di trattamento subcronico e acuto.
Questo lavoro è stato finanziato da fondi interni della Clinica Universitaria di Friburgo, dal Dipartimento di Psichiatria e Psicoterapia e dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici (a SV). TS è finanziato dalle sovvenzioni della Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450) e dell'Istituto di Studi Avanzati dell'Università di Strasburgo (USIAS) (2020-035), nonché dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Francia.
| Becher, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | qualsiasi recipiente >2000ml e diametro di 24-26 cm possibile |
| Termometro digitale | Hanna Instruments | 846-4708 | qualsiasi termometro digitale possibile |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | qualsiasi bilancia digitale possibile |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | qualsiasi standard Personalcomputer possibile |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | qualsiasi telecamera ad alta risoluzione possibile |
| Cronometro ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | qualsiasi cronometro possibile |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | qualsiasi timer possibile |
