Summary

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Published: July 08, 2021
doi:

Summary

Presentiamo un metodo per studiare l’organizzazione spaziale dei condrociti nell’anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Abstract

La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell’IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell’IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l’organizzazione spaziale dei condrociti nell’anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Introduction

Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all’architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilaginearticolare 1. Infatti, sia la degenerazione IVD che l’osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell’usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l’architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Mentre la matrice della cartilagine articolare è formata principalmente da una rete di collagene di tipo II che forma arcade, l’IVD è costituito da tre diversi tipi di tessuto: il nucleo polposo ricco di collagene di tipo II al centro assorbe carichi assiali e li trasmette a un anello comprensivo di fibre circolari di collagene di tipo I densamente imballate che è chiamato anulus fibrosus. La loro funzione è quella di assorbire le pressioni assiali tradotte ricevute dal nucleo ricco di proteoglicani e acqua con la loro resistenza longitudinale a trazione delle fibre. Nella parte superiore e inferiore di ciascun nucleo e anulus una piastra terminale cartilaginea ialina forma la giunzione alle vertebre adiacenti4 (Figura 1).

Nella cartilagine articolare si possono trovare quattro distinti modelli spaziali di condrociti: coppie, stringhe, doppie corde, piccoli gruppi rispettivamente grandi5,6,7 (Figura 2). I cambiamenti in questo modello sono associati all’insorgenza e alla progressione dell’OA8,9. L’organizzazione spaziale dei condrociti è anche indicativa di una proprietà funzionale diretta della cartilagine, vale a dire la sua rigidità, sottolineando la rilevanza funzionale di questo approccio di classificazione basato su immagini10,11. Questi modelli possono inoltre essere identificati con la tecnologia clinicamente disponibile già esistente12. A causa delle somiglianze tra l’IVD e la cartilagine articolare, si può ipotizzare che nell’IVD siano presenti anche modelli caratteristici di condrociti. La formazione di cluster è un fenomeno osservato anche nella IVDdegenerata 13,14.

Quando si tenta di analizzare l’organizzazione cellulare spaziale nell’IVD, è necessario superare diverse difficoltà tecniche che non sono presenti quando si studia la cartilagine articolare:

In primo luogo, l’elaborazione del tessuto stesso è molto più impegnativa rispetto alla cartilagine ialina omogenea che è in gran parte composta da collagene di tipo II. Il principale componente della fibra dell’IVD è il collagene di tipo I, il che rende molto più difficile generare sezioni istologiche sottili. Mentre nella cartilagine articolare ialina anche le sezioni spesse possono essere facilmente analizzate a causa della natura “vetrosa” del tessuto, la rete di collagene di tipo I dell’IVD è otticamente altamente impenetrabile. Per questo motivo, un forte rumore di fondo è un problema comune nell’istologia dell’IVD. Un modo rapido ed economico per penetrare questo tessuto otticamente denso è l’uso di un dispositivo di sezionamento ottico, ad esempio per mezzo di un apotome. In un tale Apotome, una griglia viene inserita nel percorso di illuminazione di un microscopio a fluorescenza convenzionale. Di fronte alla griglia è posizionata una lastra di vetro parallela al piano. Questo si inclina avanti e indietro proiettando così la griglia nell’immagine in tre diverse posizioni. Per ogni posizione z, vengono create e sovrapposte tre immagini raw con la griglia proiettata. Tramite un software speciale, è possibile calcolare la luce fuori fuoco. Il principio di base è che, se la griglia è visibile, quell’informazione è a fuoco, se non è considerata sfocata. Con questa tecnica, immagini ben focalizzate e ad alta risoluzione possono essere acquisite in un ragionevole lasso di tempo.

In secondo luogo, il tessuto è difficile da reperire da donatori umani. Quando si esegue la sostituzione totale del ginocchio, è possibile ottenere l’intera superficie dell’articolazione per ulteriori analisi durante l’intervento chirurgico. Sebbene l’artrosi di un’articolazione diartrodiale sia anche una malattia dell’intera articolazione, ci sono tuttavia forti differenze focali nella qualità della cartilagine con di solito alcune aree dell’articolazione ancora intatte, ad esempio a causa del carico ridotto in quell’area. Questa situazione è diversa nell’IVD, dove la chirurgia viene solitamente eseguita solo quando il disco viene distrutto globalmente. Quando si ottiene tessuto da donatori umani dalla sala operatoria, il tessuto è anche altamente frammentato ed è necessario allocare correttamente il tessuto a uno dei tre tipi di cartilagine dell’IVD prima di effettuare ulteriori analisi. Per consentire analisi più dettagliate anche di sezioni tissutali più grandi e per esaminare lo sviluppo embrionale dell’IVD è quindi necessaria la scelta di un organismo modello animale.

Quando si sceglie un tale organismo modello è importante avere un sistema che sia paragonabile al disco umano per quanto riguarda la sua anatomia e le sue dimensioni, il suo carico meccanico, l’attuale popolazione cellulare e la sua composizione tissutale. Ai fini della tecnica qui presentata suggeriamo l’uso del tessuto del disco lombare bovino: Una proprietà critica del disco umano con conseguente suo basso potenziale rigenerativo è la perdita di cellule notocordali durante la maturazione nel nucleo. Tuttavia, in numerosi organismi modello le cellule notocordali possono essere rilevate per tutta la loro vita. La maggior parte dei pochi animali che perdono le loro cellule notocordali come pecore, capre o cani condrodistrofi hanno un IVD che è molto più piccolo dei dischi umani. Solo i dischi bovini lombari presentano un diametro del disco sagittale paragonabile a quelli degli IVD umani15.

Un fattore chiave che porta alla degenerazione precoce del disco è l’eccessivo carico meccanico. Le pressioni intradiscali di una mucca in piedi nella colonna lombare sono di circa 0,8 MPa con la colonna vertebrale allineata orizzontalmente. Sorprendentemente queste pressioni sono paragonabili alle pressioni intradiscali lombari riportate per la colonna vertebrale umana eretta (0,5 MPa)15,16. Anche la quantità di acqua e proteoglicani nei dischi bovini è paragonabile a quella dell’IVD dei giovaniumani 17. Pertanto, sebbene il modello di movimento effettivo dei segmenti di movimento possa differire negli animali quadrupedi dall’uomo bipede, per quanto riguarda il carico totale e le caratteristiche del disco, la mucca è molto più vicina alla biologia umana rispetto ad altri modelli animali stabiliti per l’IVD come pecore e cani.

In questo protocollo presentiamo una tecnica come analizzare i cambiamenti nell’IVD dal punto di vista dell’organizzazione spaziale dei condrociti dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione dello stadio terminale.

Protocol

Per l’analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell’IVD, sono stati analizzati campioni umani. Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell’Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata…

Representative Results

Utilizzando immagini a mosaico, l’architettura dell’IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell’anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell’IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell’anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nu…

Discussion

Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall’imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell’anoulus dell’IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l’analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l’uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto. Ringraziamo Charlotte Emma Bamberger per aver contribuito ad acquisire le immagini dell’apotoma.

Materials

Amphotericin B Merck KGaA,  Germany A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus R. Langenbrinck, Germany 03-0060
ApoTome Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany
CellMask Actin Tracking Stain Thermo Fischer Scientific, US A57249
Cryostat Leica Biosystems, US CM3050S
DAPI Thermo Fischer Scientific, US D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Germany 41966052
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich, US 60004
Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 3834000604
Formaldehyde Merck KGaA,  Germany 104002
Image J 1.53a, with Cell counter plugin National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin Thermo Fischer Scientific, US A12380
Microscopic Cover Glasses R. Langenbrinck, Germany 01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker Science Sevices  GmbH, Germany N71310
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, US P4333
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,US P5119
Scalpel pf medical AG, Germany 2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Netherlands SA6255012

Riferimenti

  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
  3. Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
  4. Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
  5. Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
  6. Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  7. Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
  8. Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
  9. Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
  10. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
  11. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  12. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  13. Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
  14. Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
  15. Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
  16. Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
  17. Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
  18. Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
  19. Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
  20. Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
  21. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  22. Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
  23. Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
  24. Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
  25. Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
  26. Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
  27. Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
  28. Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
  29. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  30. Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
  31. Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
  32. Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
  33. Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
  34. Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
  35. Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
  36. McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).

Play Video

Citazione di questo articolo
Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Wolfgart, J. M., Breuer, W., Walter, C., Hofmann, U. K., Danalache, M. Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration. J. Vis. Exp. (173), e62594, doi:10.3791/62594 (2021).

View Video