Summary

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Questo documento mira a presentare un protocollo per la preparazione del riciclaggio di endosomi da cellule di mammifero utilizzando l’ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio.

Abstract

Il traffico endosomiale è un processo cellulare essenziale che regola una vasta gamma di eventi biologici. Le proteine vengono internalizzate dalla membrana plasmatica e quindi trasportate ai primi endosomi. Le proteine internalizzate potrebbero essere transitate al lisosoma per la degradazione o riciclate nella membrana plasmatica. È necessario un robusto percorso di riciclaggio endocitico per bilanciare la rimozione dei materiali di membrana dall’endocitosi. Varie proteine sono segnalate per regolare la via, tra cui ADP-ribosilazione fattore 6 (ARF6). L’ultracentrifugazione del gradiente di densità è un metodo classico per il frazionamento cellulare. Dopo la centrifugazione, gli organelli vengono sedimentati sulla loro superficie isopicnica. Le frazioni vengono raccolte e utilizzate per altre applicazioni a valle. Qui è descritto un protocollo per ottenere una frazione contenente endosomi riciclata da cellule di mammifero trasfettate utilizzando l’ultracentrifugazione del gradiente di densità. Le frazioni isolate sono state sottoposte a western blotting standard per analizzare il loro contenuto proteico. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato che il targeting della membrana plasmatica dell’inghiottimento e della motilità cellulare 1 (ELMO1), un substrato di scambio nucleotidico della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1), avviene attraverso il riciclaggio endocitico mediato da ARF6.

Introduction

Il traffico endosomiale è un processo fisiologico essenziale che coinvolge vari eventi biologici1, ad esempio il trasporto di recettori di segnalazione, canali ionici e molecole di adesione. Le proteine localizzate nella membrana plasmatica sono internalizzate dall’endocitosi2. Le proteine internalizzate vengono quindi selezionate dall’endosoma precoce3. Alcune delle proteine sono mirate ai lisosomi per la degradazione4. Tuttavia, una quantità significativa di proteine viene riciclata sulla superficie cellulare mediante un rapido riciclaggio e processi di riciclaggio lenti. Nel riciclaggio veloce, le proteine lasciano gli endosomi precoci e ritornano direttamente alla membrana plasmatica. Al contrario, nel riciclaggio lento, le proteine vengono prima selezionate nel compartimento di riciclaggio endocitico e quindi trasportate di nuovo alla membrana plasmatica. Varie proteine di carico, ad esempio clatrina, complesso retromero, complesso retriever e proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e complesso SCAR Homologue (WASH), partecipano a tali processi di riciclaggio della membrana4,5,6,7,8,9. L’equilibrio dell’endocitosi e dell’evento di riciclaggio è cruciale per la sopravvivenza cellulare e contribuisce a vari eventi cellulari10, ad esempio, adesione cellulare, migrazione cellulare, polarità cellulare e trasduzione del segnale.

ARF6, una piccola GTPasi, è un regolatore segnalato del traffico endocitico7,11,12. Di interesse, vari gruppi di ricerca hanno illustrato l’importanza dell’ARF6 nel riciclo endocitico13,14,15,16,17. Lo studio mira a studiare la relazione tra la crescita dei neuriti mediata da ARF6 e il riciclaggio endocitico. Il rapporto precedente suggerisce che l’attivazione di ARF6 è a monte dell’attività di Rac1 attraverso l’azione su ELMO1-dedicatore del complesso di citochinesi 1 (DOCK180)18. Tuttavia, il modo in cui ARF6 attiva la segnalazione Rac1 mediata da ELMO1-DOCK180 rimane poco chiaro. L’ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata impiegata per studiare il ruolo del riciclaggio endocitico mediato da ARF6 in tale processo. Usando questo, la frazione contenente endosoma di riciclaggio è stata ottenuta da lisati cellulari19. La frazione è stata sottoposta a Western blotting per l’analisi del contenuto proteico. I risultati dell’immunoblot hanno rivelato che sotto la presenza di FE65, una proteina adattatrice arricchita dal cervello, L’ARF6 attivo ha aumentato sostanzialmente il livello di ELMO1 nella frazione contenente endosoma riciclato. Il seguente protocollo include le procedure per (1) trasfettare le cellule di mammifero; (2) preparazione dei campioni e delle colonne del gradiente di densità; e (3) ottenere la frazione contenente endosomi di riciclaggio.

Protocol

1. Coltura e trasfezione cellulare di mammiferi Piastra 2 x 106 celle in una pala di coltura da 100 mm. Utilizzare quattro piatti per ogni trasfezione.NOTA: il numero di celle necessarie può variare a seconda delle diverse linee di cella. L’ottimizzazione può essere necessaria prima di procedere alla fase di isolamento. Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore. 2. Raccolta delle cellule …

Representative Results

Dopo aver frazionato le cellule HEK293 non trasfettate mediante ultracentrifugazione del gradiente di densità, sono state raccolte 12 frazioni a partire dalla parte superiore del gradiente. Le frazioni raccolte sono state diluite con il tampone di diluizione in rapporto 1:1 e sottoposte ad un secondo ciclo di centrifugazione. I campioni sono stati quindi sottoposti a western blotting per analizzare il loro contenuto proteico. Come mostrato nella Figura 1, il marcatore endosoma di riciclaggi…

Discussion

Il protocollo di cui sopra delinea le procedure per isolare gli endosomi di riciclaggio dalle cellule coltivate mediante ultracentrifugazione. L’affidabilità di questo metodo è stata dimostrata dall’ultima pubblicazione22, dimostrando che gli endosomi di riciclaggio sono isolati con successo da altri organelli (Figura 1), come l’apparato di Golgi e i mitocondri. Alcuni passaggi critici devono essere prestati attenzione per ottenere un buon risultato di separazione. …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council di Hong Kong, del programma di sovvenzioni dirette CUHK, del fondo di dotazione United College e del TUYF Charitable Trust. Le cifre di questo lavoro sono state adattate dalla nostra precedente pubblicazione, “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” pubblicata sul FASEB Journal nell’ottobre 2020.

Materials

1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

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