Summary

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

Published: September 02, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l’infarto miocardico nei topi preservando il pericardio e il suo contenuto.

Abstract

Questo protocollo ha dimostrato che il pericardio e il suo contenuto svolgono un ruolo antifibrotico essenziale nel modello ischemico di roditore (legatura coronarica per indurre lesioni miocardiche). La maggior parte dei modelli preclinici di infarto miocardico richiedono l’interruzione dell’integrità pericardica con perdita dell’ambiente cellulare omeostatico. Tuttavia, recentemente abbiamo sviluppato una metodologia per indurre l’infarto miocardico, che riduce al minimo il danno pericardico e mantiene la popolazione di cellule immunitarie residenti nel cuore. È stato osservato un miglioramento del recupero funzionale cardiaco nei topi con uno spazio pericardico intatto dopo la legatura coronarica. Questo metodo offre l’opportunità di studiare le risposte infiammatorie nello spazio pericardico dopo infarto miocardico. L’ulteriore sviluppo delle tecniche di etichettatura può essere combinato con questo modello per comprendere il destino e la funzione delle cellule immunitarie pericardiche nella regolazione dei meccanismi infiammatori che guidano il rimodellamento nel cuore, compresa la fibrosi.

Introduction

Ad oggi, le malattie cardiovascolari (CVD) sono riconosciute come la principale causa di morte a livello globale, con conseguente significativo onere finanziario e riduzione della qualità della vita dei pazienti1. La malattia coronarica (CAD) è un sottotipo di CVD e svolge un ruolo essenziale nello sviluppo dell’infarto miocardico (IM), che è uno dei principali contributori alla mortalità. Per definizione, l’infarto miocardico deriva da lesioni irreversibili al tessuto miocardico dovute a condizioni prolungate di ischemia e ipossia. Il tessuto miocardico manca di capacità di rigenerazione, quindi le lesioni sono permanenti e comportano la sostituzione del muscolo cardiaco con una cicatrice fibrotica che può essere inizialmente protettiva, ma alla fine contribuisce al rimodellamento cardiaco avverso e all’eventuale insufficienza cardiaca2.

Sebbene la gestione dei pazienti con CAD sia notevolmente migliorata negli ultimi decenni, l’insufficienza cardiaca cronica (CHF) secondaria a ischemia colpisce molti pazienti in tutto il mondo. Per prevenire e gestire questa epidemia, è necessario comprendere più ampiamente i meccanismi sottostanti e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Inoltre, i risultati precedenti evidenziano i limiti della terapia sistemica e la necessità di sviluppare alternative precise. Dato che lo studio delle sequele molecolari dell’infarto miocardico nell’uomo è influenzato dalla capacità di accedere al tessuto infartuato, sono indispensabili modelli animali che ricapitolino le caratteristiche e lo sviluppo dell’infarto miocardico umano e della CHF correlati alla CVD.

Poiché i modelli animali ideali assomigliano molto a un disturbo umano per caratteristiche strutturali e funzionali, l’eziologia della malattia dovrebbe guidare il loro concepimento. Nella CAD, è la stenosi aterosclerotica cronica delle arterie coronarie o occlusione trombotica acuta. Diversi metodi sono stati sviluppati e applicati in varie specie di animali da laboratorio per indurre il restringimento o l’occlusione dell’arteria coronaria. Tali strategie possono essere ampiamente classificate in due gruppi: (1) manipolazione meccanica di un’arteria coronaria per indurre un MI e (2) accelerazione dell’aterosclerosi per facilitare il restringimento coronarico che porta a un IM. La prima strategia di solito comporta la legatura di un’arteria coronaria o il posizionamento di uno stent all’interno dell’arteria. Il secondo approccio tende a basarsi sulla modifica della dieta dell’animale per includere alimenti ricchi di grassi / colesterolo. Alcuni dei limiti di quest’ultimo approccio includono la mancanza di controllo sui tempi e sul sito delle occlusioni coronariche.

Al contrario, l’induzione chirurgica di infarto miocardico o ischemia in un modello animale ha diversi vantaggi, come la posizione, i tempi precisi e l’estensione dell’evento coronarico, portando a risultati più riproducibili. Il metodo più utilizzato è la legatura chirurgica dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD). Tali modelli riassumono le risposte umane al danno ischemico acuto, nonché la progressione a CHF3. Inizialmente sviluppata in animali più grandi, la chirurgia LAD su piccoli animali come i roditori è diventata più fattibile con i progressi della tecnologia4. Nello stabilire tali modelli, i topi sono stati favoriti per vari motivi, tra cui la loro relativa disponibilità, la bassa spesa per l’alloggio e la loro capacità di manipolazione genetica.

I modelli chirurgici contemporanei di cardiopatia ischemica che utilizzano l’occlusione LAD richiedono al ricercatore di aprire il pericardio per legare temporaneamente o permanentemente l’arteria5. Tali strategie comportano l’interruzione dello spazio pericardico, che svolge una funzione essenzialmente meccanica e lubrificante per garantire una corretta funzione cardiaca. Un altro svantaggio dell’apertura del pericardio è la perdita del liquido pericardico nativo dell’animale con i suoi vari componenti cellulari e proteici 6,7. In risposta, abbiamo sviluppato un metodo per indurre l’infarto miocardico mantenendo intatto il pericardio. Oltre a ridurre al minimo la perturbazione di questo ambiente omeostatico, questo approccio consente di etichettare e tracciare cellule specifiche dopo aver causato un MI. Inoltre, questo approccio rappresenta meglio la lesione ischemica miocardica in ambito umano.

Protocol

Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL / 6J tra 8-14 settimane di età. Questo protocollo ha ricevuto l’approvazione etica dal Comitato per la cura degli animali dell’Università di Calgary e segue tutte le linee guida sulla cura degli animali. 1. Preparazione e chirurgia del topo Sterilizzare gli strumenti chirurgici (tramite sterilizzatore di perline o autoclave). Pesare il topo per il peso prechirurgico e la dose analgesica. Po…

Representative Results

Questo modello di legatura coronarica modificato è stato ottimizzato per ottenere la riproducibilità e la sopravvivenza degli animali. Tuttavia, a causa della significativa lesione indotta nel cuore, alcune attese mortalità intraoperatoria e post-operatoria sono associate alla procedura. La mortalità standard è tipicamente più alta nei maschi (~25-35%) rispetto alle femmine (~ 10-15%). L’induzione riuscita di un infarto miocardico con la legatura coronarica modificata dovrebbe essere evi…

Discussion

L’induzione di un infarto miocardico in un pericardio chiuso nei roditori è unica e può avere applicazioni potenzialmente significative. La procedura si basa fortemente sulla familiarità del chirurgo con il modello di roditore e l’anatomia cardiaca del roditore. Il successo dipende anche dalla cura prestata durante tre fasi critiche: incisione muscolare intercostale e retrazione delle costole (fasi 1.11-1.13), creazione dell’infarto (fase 1.17) e recupero degli animali (fasi 1.22-1.24).

La …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

Steri-350 Bead Sterilizer Inotech NC9449759
10% Formalin Millipore Sigma HT501128-4L
40 µm Cell strainer VWR CA21008-949 Falcon, 352340
70 µm Cell strainer VWR CA21008-952 Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer Thermo Fisher A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" CDMV Inc 108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution) CDMV Inc 104826
Blunt Forceps Fine Science Tools FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment CDMV Inc 17909
Castroviejo Needle Driver Fine Science Tools FST 12061-01
Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
Collagenase I Millipore Sigma SCR103
Collagenase XI Millipore Sigma C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture – CV-11 taper needle Medtronic Canada GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture – PC-13 cutting needle Medtronic Canada SL-1659
Curved Blunt Forceps Fine Science Tools FST 11009-13
Dako Mounting Medium Agilen CS70330-2
DNase I Millipore Sigma 11284932001
Ethanol, 100% Millipore Sigma MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture – BV-130-4 taper needle Johnson & Johnson Inc. 2815G
Fiber-Optic Light Nikon 2208502
Fine Forceps Fine Science Tools FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm Polysciences, Inc. 15702
Geiger Thermal Cautery Unit World Precision Instruments 501293 Model 150-ST
Hyaluronidase Millipore Sigma H4272
Isofluorane Vaporizer Harvard Apparatus 75-0951
Isoflurane USP, 250 mL CDMV Inc 108737
Magnetic Fixator Retraction System Fine Science Tools 18200-20
MX550D- 40 MHz probe Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver Fine Science Tools FST 12002-12
PE-10 Tubing Braintree Scienctific, Inc. PE10 50 FT
Scissors Fine Science Tools FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope Nikon SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) CDMV Inc 124918 controlled drug
Vevo 2100 Software Fujifilm-Visual Sonics

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Fatehi Hassanabad, A., Belke, D. D., Turnbull, J., Dundas, J. A., Vasanthan, V., Teng, G., Fedak, P. W. M., Deniset, J. F. An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model. J. Vis. Exp. (175), e62720, doi:10.3791/62720 (2021).

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