Summary

Un modello preclinico di colpo di calore da sforzo nei topi

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

Il protocollo descrive lo sviluppo di un modello standardizzato, ripetibile, preclinico di colpo di calore da sforzo (EHS) in topi privi di stimoli esterni avversi come scosse elettriche. Il modello fornisce una piattaforma per studi meccanicistici, preventivi e terapeutici.

Abstract

Il colpo di calore è la manifestazione più grave delle malattie legate al calore. Il colpo di calore classico (CHS), noto anche come colpo di calore passivo, si verifica a riposo, mentre il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica durante l’attività fisica. L’EHS differisce dalla CHS in eziologia, presentazione clinica e sequele di disfunzione multiorgano. Fino a poco tempo fa, solo i modelli di CHS sono stati ben consolidati. Questo protocollo mira a fornire linee guida per un raffinato modello murino preclinico di EHS che sia privo di importanti fattori limitanti come l’uso di anestesia, contenimento, sonde rettali o scosse elettriche. In questo modello sono stati utilizzati topi C57Bl/6 maschi e femmine, strumentati con sonde telemetriche di temperatura interna (Tc). Per familiarizzare con la modalità di corsa, i topi si sottopongono a 3 settimane di allenamento utilizzando ruote da corsa sia volontarie che forzate. Successivamente, i topi corrono su una ruota forzata all’interno di una camera climatica impostata a 37,5 °C e 40%-50% di umidità relativa (RH) fino a mostrare una limitazione dei sintomi (ad esempio, perdita di coscienza) a Tc di 42,1-42,5 °C, sebbene si possano ottenere risultati adeguati a temperature della camera comprese tra 34,5-39,5 °C e umidità tra il 30% e il 90%. A seconda della gravità desiderata, i topi vengono rimossi immediatamente dalla camera per il recupero a temperatura ambiente o rimangono nella camera riscaldata per una durata più lunga, inducendo un’esposizione più grave e una maggiore incidenza di mortalità. I risultati vengono confrontati con controlli di esercizio fittizi (EXC) e /o controlli ingenui (NC). Il modello rispecchia molti dei risultati fisiopatologici osservati nell’EHS umano, tra cui perdita di coscienza, grave ipertermia, danno multiorgano e rilascio di citochine infiammatorie e risposte di fase acuta del sistema immunitario. Questo modello è ideale per la ricerca basata su ipotesi per testare strategie preventive e terapeutiche che possono ritardare l’insorgenza di EHS o ridurre il danno multi-organo che caratterizza questa manifestazione.

Introduction

Il colpo di calore è caratterizzato da disfunzione del sistema nervoso centrale e successivo danno d’organo in soggetti ipertermici1. Ci sono due manifestazioni di colpo di calore. Il colpo di calore classico (CHS) colpisce soprattutto le popolazioni anziane durante le ondate di calore o i bambini lasciati in veicoli esposti al sole durante le calde giornateestive 1. Il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica quando vi è un’incapacità di termoregolarsi adeguatamente durante lo sforzo fisico, tipicamente, ma non sempre, a temperature ambiente elevate con conseguenti sintomi neurologici, ipertermia e successiva disfunzione e danno multiorgano2. L’EHS si verifica negli atleti ricreativi e d’élite, nonché nel personale militare e nei lavoratori con e senza disidratazione concomitante3,4. Infatti, l’EHS è la terza causa di mortalità negli atleti durante l’attività fisica5. È estremamente difficile studiare l’EHS negli esseri umani in quanto l’episodio può essere letale o portare a esiti negativi sulla salute a lungo termine6,7. Pertanto, un modello preclinico affidabile di EHS potrebbe servire come strumento prezioso per superare i limiti delle osservazioni cliniche retrospettive e associative nelle vittime di EHS umane. I modelli preclinici di CHS in roditori e suini sono stati ben caratterizzati8,9,10. Tuttavia, i modelli preclinici di CHS non si traducono direttamente in fisiopatologia EHS a causa degli effetti unici dell’esercizio fisico sul profilo termoregolatore e sulla risposta immunitaria innata11. Inoltre, i precedenti tentativi di sviluppare modelli EHS preclinici nei roditori hanno posto restrizioni significative, tra cui stimoli di stress sovrapposti indotti da scosse elettriche, inserimento di una sonda rettale e temperature corporee interne massime predefinite con alti tassi di mortalità12,13,14,15,16 che non corrispondono ai dati epidemiologici attuali. Questi rappresentano limitazioni significative che possono confondere l’interpretazione dei dati e fornire indici di biomarcatori inaffidabili. Pertanto, il protocollo mira a caratterizzare e descrivere i passaggi di un modello preclinico standardizzato, altamente ripetibile e traducibile di EHS nei topi che è in gran parte privo delle limitazioni sopra menzionate. Vengono descritti gli aggiustamenti al modello che possono portare a esiti fisiologici graduali da colpo di calore moderato a fatale. Per quanto a conoscenza degli autori, questo è l’unico modello preclinico di EHS con tali caratteristiche, che consente di perseguire la ricerca EHS pertinente in modo basato su ipotesi11,17,18.

Protocol

Tutte le procedure sono state riviste e approvate dalla IACUC dell’Università della Florida. Per lo studio vengono utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J, di età compresa tra ~ 4 mesi, di peso compreso tra 27-34 g e 20-25 g, rispettivamente. 1. Impianto chirurgico del sistema di monitoraggio telemetrico della temperatura All’arrivo dal venditore, consentire agli animali di riposare nel vivaio per almeno 1 settimana prima dell’intervento chirurgico per ridurre al minimo lo stre…

Representative Results

I tipici profili termoregolatori durante l’intero protocollo EHS e il recupero precoce di un topo sono illustrati nella Figura 1A. Questo profilo comprende quattro fasi distinte che possono essere definite come la fase di riscaldamento della camera, la fase di esercizio incrementale, la fase di esercizio allo stato stazionario e una fase di recupero mediante un metodo di raffreddamento rapido (R) o severo (S)17. I principali risultati termoregolatori includono il mass…

Discussion

Questa revisione tecnica mira a fornire linee guida per le prestazioni di un modello preclinico di EHS nei topi. Vengono forniti passaggi dettagliati e materiali necessari per l’esecuzione di un episodio EHS riproducibile di gravità variabile. È importante sottolineare che il modello imita in gran parte i segni, i sintomi e la disfunzione multiorgano osservati nelle vittime umane di EHS11,19. Inoltre, questo modello consente di esaminare il meccanismo alla base…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa W81XWH-15-2-0038 (TLC) e BA180078 (TLC) e dal BK and Betty Stevens Endowment (TLC). JMA è stata sostenuta da aiuti finanziari del Regno dell’Arabia Saudita. Michelle King era con l’Università della Florida al momento in cui è stato condotto questo studio. Attualmente è impiegata presso il Gatorade Sports Science Institute, una divisione di PepsiCo R&D.

Materials

 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12×18 Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit  DR Instruments
Energizer Power Supply Starr Life Sciences
G2 Emitteret al. Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane Patterson Veterinary
Platform receiveret al. Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911 ThermoForma
Training Wheels  Columbus Inst.

Riferimenti

  1. Leon, L. R., Bouchama, A. Heat stroke. Comprehensive Physiology. 5 (2), 611-647 (2015).
  2. Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
  3. King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
  4. Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
  5. Howe, A. S., Boden, B. P. Heat-related illness in athletes. The American Journal of Sports Medicine. 35 (8), 1384-1395 (2007).
  6. Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
  7. Wang, J. -. C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
  8. Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
  9. Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
  10. Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
  11. King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
  12. Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
  13. Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
  14. Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
  15. Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
  16. Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
  17. Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), 841-849 (2018).
  18. Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
  19. King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), (2015).
  20. Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
  21. Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
  22. Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
  23. Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
  24. He, S. -. X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  25. Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
  26. Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), 115-123 (2020).
  27. Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O’Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).

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Citazione di questo articolo
King, M. A., Alzahrani, J. M., Clanton, T. L., Laitano, O. A Preclinical Model of Exertional Heat Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62738, doi:10.3791/62738 (2021).

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