Qui presentiamo un protocollo per l’impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l’imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.
Le metastasi, che rappresentano circa il 90% della mortalità correlata al cancro, comportano la diffusione sistemica delle cellule tumorali dai tumori primari ai siti secondari come l’osso, il cervello e il polmone. Sebbene ampiamente studiati, i dettagli meccanicistici di questo processo rimangono poco compresi. Mentre le modalità di imaging comuni, tra cui la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI), offrono vari gradi di visualizzazione grossolana, ognuna manca della risoluzione temporale e spaziale necessaria per rilevare la dinamica delle singole cellule tumorali. Per risolvere questo problema, sono state descritte numerose tecniche per l’imaging intravitale di siti metastatici comuni. Di questi siti, il polmone si è dimostrato particolarmente difficile da accedere per l’imaging intravitale a causa della sua delicatezza e del suo ruolo critico nel sostenere la vita. Sebbene in precedenza siano stati descritti diversi approcci per l’imaging intravitale a singola cellula del polmone intatto, tutti comportano procedure altamente invasive e terminali, limitando la durata massima possibile dell’imaging a 6-12 ore. Qui è descritta una tecnica migliorata per l’impianto permanente di una finestra ottica toracica minimamente invasiva per l’imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL). In combinazione con un approccio adattato alla microcartografia, l’innovativa finestra ottica facilita l’imaging intravitale seriale del polmone intatto a risoluzione a singola cellula in più sessioni di imaging e per più settimane. Data la durata senza precedenti del tempo in cui i dati di imaging possono essere raccolti, il WHRIL può facilitare la scoperta accelerata dei meccanismi dinamici alla base della progressione metastatica e di numerosi processi biologici aggiuntivi all’interno del polmone.
Responsabile di circa il 90% dei decessi, la metasta è la principale causa di mortalità correlata al cancro1. Tra i principali siti di metastasi clinicamente osservate (ossa, fegato, polmone, cervello)2, il polmone si è dimostrato particolarmente impegnativo per l’imaging in vivo tramite microscopia intravitale. Questo perché il polmone è un organo delicato in moto perpetuo. Il movimento continuo dei polmoni, ulteriormente aggravato dal movimento cardiaco intratoracico, rappresenta una barriera sostanziale per l’imaging accurato. Pertanto, a causa della sua relativa inaccessibilità alle modalità per l’imaging ottico intravitale ad alta risoluzione, la crescita del cancro all’interno del polmone è stata spesso considerata un processo occulto3.
In ambito clinico, le tecnologie di imaging come la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI) consentono la visualizzazione in profondità all’interno di organi vitali intatti come il polmone4. Tuttavia, mentre queste modalità forniscono eccellenti viste dell’organo grossolano (spesso anche rivelando la patologia prima dell’insorgenza dei sintomi clinici), sono di risoluzione inadeguata per rilevare le singole cellule tumorali disseminate mentre avanzano attraverso le prime fasi delle metastasi. Di conseguenza, nel momento in cui le modalità di cui sopra forniscono qualsiasi indicazione di metastasi al polmone, i focolai metastatici sono già ben consolidati e proliferanti. Poiché il microambiente tumorale svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro e nella formazione di metastasi5,6,c’è un grande interesse nello studio dei primi passi della semina metastatica in vivo. Questo interesse è ulteriormente alimentato dal maggiore apprezzamento che le cellule tumorali si diffondono anche prima che il tumore primario venga rilevato7,8 e dalla crescente evidenza che sopravvivono come singole cellule e in uno stato dormiente per anni o decenni prima di crescere in macro-metastasi9.
In precedenza, l’imaging del polmone a risoluzione monocellulare ha necessariamente coinvolto preparati ex vivo o di espianto10,11,12,13,limitando le analisi a singoli punti temporali. Mentre questi preparati forniscono informazioni utili, non forniscono alcuna visione della dinamica delle cellule tumorali all’interno dell’organo collegato a un sistema circolatorio intatto.
I recenti progressi tecnologici nell’imaging hanno permesso la visualizzazione intravitale del polmone intatto a risoluzione unicellulare per periodi fino a 12 h14,15,16. Ciò è stato realizzato in un modello murino utilizzando un protocollo che prevedeva la ventilazione meccanica, la resezione della gabbia toracica e l’immobilizzazione polmonare assistita dal vuoto. Tuttavia, nonostante offra le prime immagini a risoluzione cellulare singola del polmone fisiologicamente intatto, la tecnica è altamente invasiva e terminale, precludendo così ulteriori sessioni di imaging oltre la procedura di indice. Questa limitazione, quindi, impedisce la sua applicazione allo studio di passaggi metastatici che richiedono più di 12 ore, come la dormienza e il riavvio dellacrescita 14,15,16. Inoltre, i modelli di comportamento cellulare osservati utilizzando questo approccio di imaging devono essere interpretati con cautela, dato che i differenziali di pressione indotti dal vuoto possono causare deviazioni nel flusso sanguigno.
Per superare queste limitazioni, è stata recentemente sviluppata una finestra minimamente invasiva per l’imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL), che facilita l’imaging seriale per un periodo prolungato di giorni o settimane, senza la necessità di ventilazione meccanica17. La tecnica prevede la creazione di una ‘gabbia toracica trasparente’ con una cavità toracica sigillata per il mantenimento della normale funzione polmonare. La procedura è ben tollerata, consentendo al mouse di recuperare senza alterazioni significative dell’attività e della funzione di base. Per localizzare in modo affidabile esattamente la stessa regione polmonare in ogni rispettiva sessione di imaging, a questa finestra18è stata applicata una tecnica nota come microcartografia. Attraverso questa finestra, è stato possibile catturare immagini di cellule mentre arrivano al letto vascolare del polmone, attraversano l’endotelio, subiscono la divisione cellulare e crescono in micro-metastasi.
Qui, lo studio presenta una descrizione dettagliata di un protocollo chirurgico migliorato per l’impianto del WHRIL, che semplifica l’intervento chirurgico aumentando contemporaneamente la sua riproducibilità e qualità. Mentre questo protocollo è stato progettato per consentire lo studio dei processi dinamici alla base delle metastasi, la tecnica può essere applicata alternativamente alle indagini di numerosi processi di biologia e patologia polmonare.
Nei siti di metastasi a distanza come il polmone, l’imaging ottico ad alta risoluzione fornisce informazioni sulle elaborate dinamiche delle metastasi delle cellule tumorali. Consentendo la visualizzazione in vivo di singole cellule tumorali e delle loro interazioni con il tessuto ospite, l’imaging intravitale ad alta risoluzione si è dimostrato strumentale alla comprensione dei meccanismi alla base delle metastasi.
Qui è descritto un protocollo chirurgico migliorato per l’impianto …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 di Montefiore, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo Integrated Imaging Program, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Vorremmo ringraziare l’Analytical Imaging Facility (AIF) presso l’Einstein College of Medicine per il supporto di imaging.
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |