Articolo metodologico

Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

DOI:

10.3791/62913

⸱

13 ottobre 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

In questo articolo

Sommario

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La distanza spaziale è un parametro chiave nella valutazione del danno da ipossia/riossigenazione in un modello di co-coltura di strati cellulari endoteliali e cardiomiociti separati, suggerendo, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti.

Abstract

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La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo. La riperfusione provoca ulteriori lesioni oltre l'ischemia. Le cellule endoteliali (CE) possono proteggere i cardiomiociti (CM) dalle lesioni da riperfusione attraverso le interazioni cellula-cellula. Le co-colture possono aiutare a studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula. Una co-coltura mista è l'approccio più semplice, ma è limitata in quanto i trattamenti isolati e le analisi a valle di singoli tipi di cellule non sono fattibili. Per indagare se le CE possono attenuare in modo dose-dipendente il danno alle cellule CM e se questa protezione può essere ulteriormente ottimizzata variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari, abbiamo utilizzato le cellule endoteliali dell'arteria coronaria primaria del topo e i cardiomiociti del topo adulto per testare tre tipi di inserti di coltura cellulare che variavano nella loro distanza dello strato intercellulare a 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. Solo nelle CM, il danno cellulare valutato dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) è aumentato significativamente durante l'ipossia e ulteriormente dopo la riossigenazione quando la distanza era di 2,0 mm rispetto a 0,5 e 1,0 mm. Quando le EC e le CM erano in contatto quasi diretto (0,5 mm), c'era solo una lieve attenuazione del danno da riossigenazione delle CM a seguito di ipossia. Questa attenuazione è stata significativamente aumentata quando la distanza spaziale era di 1,0 mm. Con una distanza di 2,0 mm, le CE hanno attenuato la lesione della CM sia durante l'ipossia che durante l'ipossia / riossigenazione, indicando che è necessario un sufficiente distanziamento di coltura per le CE per incrociare la diafonia con le CM, in modo che le molecole segnale secrete possano circolare e stimolare completamente le vie protettive. I nostri risultati suggeriscono, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura EC/CM è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo degli EC nella protezione CM contro le lesioni da ischemia/riperfusione simulate. L'obiettivo di questo rapporto è quello di fornire un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Introduzione

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La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo 1,2. Tuttavia, il processo di trattamento della riperfusione può causare la morte dei cardiomiociti, nota come lesione da ischemia / riperfusione miocardica (IR), per la quale non esiste ancora un rimedio efficace3. Le cellule endoteliali (CE) sono state suggerite per proteggere i cardiomiociti (CM) attraverso la secrezione di segnali paracrini, nonché le interazioni cellula-cellula4.

I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati....

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Protocollo

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1. Preparazione/placcatura sperimentale

  1. Mantenere CM ed EC secondo le istruzioni del produttore.
    1. Scongelare entrambe le linee cellulari quando arrivano dai fornitori. Piastra in palloni T25 dopo essere stata lavata con mezzi freschi. Si consiglia di acquistare ogni terreno di coltura cellulare dagli stessi fornitori da cui sono state acquistate le cellule. Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando sono confluenti.
    2. Mantenere l'incubatore di colture cellulari a 37 °C con 21% O2, 5% CO2, 74% N2 e mantenerlo umidificato.
      NOTA: Le cellule endoteliali dell'a....

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Risultati

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Tutti e tre i tipi di inserti (A, B, C) utilizzati in questo esperimento hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L'unica differenza tra loro è l'altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente di 0,5, 1,0 e 2,0 mm (Figura 3) e che provengono da fornitori diversi (per i dettagli vedere Tabella dei materiali).

Per stabilire un modello di co-coltura in vitro con s.......

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Discussione

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Passaggi critici nel protocollo
Modelli di co-coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare i meccanismi cellulari di cardioprotezione. Come creare due strati separati con una distanza significativa tra loro è, quindi, cruciale per lo sviluppo di un modello di co-cultura adatto. Una sfida nello studio della lesione IR simulata, cioè HR, è che non solo l'ischemia (ipossia) stessa, ma anche la riperfusione (reossigenazione) aggrava la disfunzione cellulare. Pertanto, un modello realistico deve ri.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal servizio di ricerca e sviluppo del laboratorio biomedico del Dipartimento degli affari dei veterani degli Stati Uniti (I01 BX003482) e da fondi istituzionali a M.L.R.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cardiomiociti di topo adulto (CM)Celprogen Inc11041-14Isolato da tessuto cardiaco di topo adulto C57BL/6J
Contatore di cellule automatizzato Countess IIInvitrogenA27977Conteggio delle cellule per il calcolo del numero
di cellule Armadio di sicurezza biologicaNuaireNU425400Cappuccio sterile per colture cellulari
Congelamento di colture cellulari MediumCell Biologics Inc6916Utilizzato per il congelamento delle cellule per la conservazione a lungo termine di linee cellulari
Incubatore per colture cellulariNuaireNu-5500Per fornire le normali condizioni di vita cellulare (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37° C, umidificato)
Serbatoio del gas dell'incubatore per colture cellulariA-L Gas compressiUN1013Gas necessario per l'incubatore per colture cellulari 
Inserti per colture cellulari A (0,5 mm)Corning Inc353095Utilizzato per la co-coltura EC-CM
Inserti per colture cellulari B (1,0 mm)Millicell MilliporePIHP01250Utilizzato per la co-coltura EC-CM
Inserti per colture cellulari C (2,0 mm)Greiner Bio-One662640Utilizzato per centrifuga di co-coltura EC-CM
Anstel Enterprises Inc4235Per la placcatura e il passaggio di colture cellulari
Fiasche per colture cellulari CMs T25Celprogen IncE11041-14Utilizzato per la coltura regolare di CM, rivestito dal produttore
Terreno di coltura cellulare CMs CompletoCelprogen IncM11041-14STerreno di coltura completo per colture
cellulari CMs Terreno di coltura cellulare completoCelprogen IncM11041-14PNTerreno di coltura CM senza rosso fenolo utilizzato durante la misurazione LDH
Piastre per colture cellulari CMs 96 pozzettoCelprogen IncE11041-14-96wellUtilizzato per esperimenti di misurazione LDH, rivestito dal produttore
CMs Medium Hypoxia Cell CultureCelprogen IncM11041-14GFPNCMs coltura cellulare in condizioni ipossiche (senza glucosio e siero)
Countess cell counting chamber vetriniInvitrogenC10283Vetrini di conteggio utilizzati per il contatore cellulare
Cyquant LDH Cytotoxicity KitThermo Scientific C20301Kit di misurazione LDH
ECs Fiasche per colture cellulari T25Fisher Scientific FB012935Utilizzato per la coltura regolare delle EC
Terreno di coltura cellulare EC CompleteCell Biologics IncM1168Terreno completo per colture EC
Terreno di coltura cellulare completo privo di fenoloCell Biologics IncM1168PFTerreno di coltura EC senza rosso fenolo utilizzato durante la misurazione dell'LDH
Piastre per colture cellulari EC a 96 pozzettiFisher Scientific (Costar)3370Utilizzato per esperimenti di LDH Cell
Biologics Inc6950Utilizzato per il rivestimento di fiasche e piastre per EC
ECs Coltura cellulare di ipossia MediumCell Biologics IncGPF1168Coltura cellulare EC in condizioni di ipossia (senza glucosio e siero)
Siero fetale bovino (FBS)Fisher ScientificMT35011CV FBS-HI APPROVATO USDA per la coltura cellulare e il mantenimento
Camera di ipossiaStemCell Technologies27310Per creare una condizione di ipossia con 0,01% di O2
temperatura Misuratore di portata della camera di ipossiaStemCell Technologies27311Per il collegamento con il serbatoio del gas ipossico per una velocità costante del flusso di gas
Serbatoio di gas ipossico (0,01% O2 Cilindro)A-L Gas compressiUN1956Utilizzato per il lavaggio del mezzo ipossico e della camera (0,01% O2/5% CO2/94,99N2
)Microscopio NikonTMSPer osservare le condizioni cellulari
Topo Primario Arteria coronarica Cellule endoteliali (CE)Cell Biologics IncC57-6093Isolato dall'arteria coronaria di topi C57BL/6
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269Per il processo di coltura cellulare, esperimenti, preparazione di soluzioni, ecc.
NUNC 50ML CONICL TubesFisher Scientific12565271Per processi di coltura cellulare, esperimenti, preparazione di soluzioni, ecc.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8662Utilizzato per il lavaggio cellulare durante la coltura o gli esperimenti
Lettore di piastre StrumentoBioTek11120533Lettura colorimetrica o fluorimetrica delle piastre
Reazione 96 Well Palte (trasparente senza coperchio)Fisher Scientific12565226Utilizzato per la lettura di piastre di misurazione LDH
Tripsina/EDTA per CMCelprogen IncT1509-0141 x filtrato sterile e testato per colture tissutali
Tripsina/EDTA per ECCell Biologics Inc6914/06190,25%, testato per cutura cellulare
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....

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Danno da riperfusionecellule endotelialicardiomiocitiipossia riossigenazionerilascio di LDHinterazioni cellula cellulamodello in vitroinserti per coltura

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