Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo ^1,2. Tuttavia, il processo di trattamento della riperfusione può causare la morte dei cardiomiociti, nota come lesione da ischemia / riperfusione miocardica (IR), per la quale non esiste ancora un rimedio efficace³. Le cellule endoteliali (CE) sono state suggerite per proteggere i cardiomiociti (CM) attraverso la secrezione di segnali paracrini, nonché le interazioni cellula-cellula⁴.

I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula autocrine e/o paracrine sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tra i modelli di co-coltura, la co-coltura mista è la più semplice, in cui due diversi tipi di cellule sono in contatto diretto all'interno di un singolo compartimento di coltura con un rapporto cellulare desiderato⁵. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili data la popolazione mista.

Studi precedenti hanno indicato che gli insulti ipossici e ischemici causano danni significativi all'integrità della membrana cellulare misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH). Questa lesione è peggiorata con la riossigenazione, imitando la lesione da riperfusione ^6,7,8. L'obiettivo dell'attuale protocollo era quello di testare le ipotesi che la presenza di EC possa attenuare in modo dose-dipendente la perdita di CM della membrana cellulare causata da ipossia e riossigenazione (HR) e che l'effetto protettivo degli EC possa essere ottimizzato variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari. Pertanto, abbiamo impiegato tre tipi di inserti di coltura cellulare e cellule endoteliali coronariche primarie di topo e cardiomiociti di topo adulti. Gli inserti, marchiati da Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, ci hanno permesso di creare tre diverse condizioni di diafonia della coltura cellulare con distanze intercellulari di 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. 100.000 CE sono stati placcati per inserto in ciascun caso.

Inoltre, al fine di determinare se la densità delle CE in cocoltura contribuisca all'attenuazione del danno hr in questo modello, abbiamo studiato la relazione dose-risposta tra concentrazione CE e rilascio di LDH da parte dei CM. Le CE sono state placcate rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 per inserto, nell'inserto da 2,0 mm.

Questo rapporto fornisce un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

1. Preparazione/placcatura sperimentale

1. Mantenere CM ed EC secondo le istruzioni del produttore.
   1. Scongelare entrambe le linee cellulari quando arrivano dai fornitori. Piastra in palloni T25 dopo essere stata lavata con mezzi freschi. Si consiglia di acquistare ogni terreno di coltura cellulare dagli stessi fornitori da cui sono state acquistate le cellule. Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando sono confluenti.
   2. Mantenere l'incubatore di colture cellulari a 37 °C con 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ e mantenerlo umidificato.
      NOTA: Le cellule endoteliali dell'arteria coronaria primaria del topo utilizzate in questo protocollo sono isolate dalle arterie coronarie dei topi C57BL/6 e i cardiomiociti di topo adulti sono isolati da cuori di topo C57BL/6J adulti e ottenuti commercialmente (vedere Tabella dei materiali).
2. Cm di piastre in condizioni sterili sul fondo di piastre a 24 pozzetti (strato inferiore). 24 ore dopo, placcare ECs nell'inserto (o porzione superiore) del pozzo di co-coltura. 24 ore dopo la placcatura CE, posizionare gli inserti EC su basi di piastre CM, iniziando il periodo di co-coltura. Lasciare che le cellule co-colturano per almeno 12-24 ore prima dell'uso. Questi passaggi sono descritti in dettaglio di seguito.
   1. Stimare la confluenza della linea cellulare CM al microscopio ottico. Quando le cellule sembrano essere confluenti al 90%-100% nei palloni di coltura, procedere con la placcatura sperimentale.
   2. Rimuovere il materiale dai palloni contenenti colture cellulari confluenti e tripsinizzare con 3-5 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per i palloni T25. Agitare delicatamente il matraccio, incubare a 37 °C per 2-5 minuti, quindi valutare i progressi enzimatici al microscopio ottico. Una volta che le cellule iniziano ad arrotondare, utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule dalla superficie.
   3. Dopo il distacco, inattivare la soluzione di tripsina aggiungendo la soluzione di tripsina/cella a un tubo da 50 mL contenente 10 mL di fluido per i palloni T25. Centrifugare la sospensione cellulare a 120 x g per 2 minuti per ottenere un pellet a celle morbide. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 5 ml di supporto.
   4. Per eseguire il conteggio cellulare e confermare la vitalità cellulare, mescolare un'aliquota di 10 μL di cellule risospese e 10 μL di colorante blu di tripano. Conta le cellule viventi usando un contatore di celle. Diluire le cellule con mezzi regolari freschi per ottenere le densità di semina desiderate. I volumi sono calcolati in base alla densità di seme desiderata e alla concentrazione cellulare delle soluzioni madre. Tutta la placcatura deve essere eseguita in condizioni sterili.
   5. CM di piastra a densità di semina di 300.000 per pozzetto sul fondo di una piastra a 24 pozzetti pre-rivestita con matrice extracellulare. Mantenere le celle a 37 °C con il 21% di O_{2 e} il 5% di CO₂ durante la notte.
   6. Dopo 24 ore, le cec della piastra in inserti ad una densità di placcatura ottimale di 100.000 per inserto (l'area di coltura è di 33,6 mm²) (Figura 1). Dopo 24 ore di placcatura CE, posizionare gli inserti EC all'interno dei pozzetti CM, avviando la co-coltura. Consentire alle cellule di co-coltivare per 12-24 ore prima di eseguire gli esperimenti.
   7. Assicurarsi che, al momento dell'esecuzione degli esperimenti, sia i CM che gli EC abbiano raggiunto l'80%-90% di confluenza.

2. Ipossia/reossigenazione per simulare ischemia/danno da riperfusione in vitro

NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti come descritto, non mettere in pausa nel mezzo.

1. Preparare il mezzo ipossico versando ~ 25 ml di media in un tubo conico da 50 ml. Sigillare ad aria la parte superiore con una membrana in silicone e utilizzare una pipetta sterilizzata per praticare un foro. Creare un altro foro, questa volta lasciando la pipetta immersa di circa 2/3 nel supporto.
2. Lavare il fluido con gas ipossico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) per 5 minuti ad una portata di 30 L/min. Ciò riduce al minimo l'O₂ disciolto nel mezzo quando inizia l'ipossia (passaggio 2.5).
3. Scartare il mezzo delle piastre a 24 pozzetti o degli inserti di coltura contenenti cellule attaccate e lavare con 100 μL/pozzetto di 10% di fosfato tamponato saline (PBS) molto delicatamente. Successivamente, aggiungere 500 μL del mezzo ipossico appena preparato a ciascun pozzetto delle piastre o degli inserti.
   NOTA: l'ipossia nei media viene interrotta il più brevemente possibile durante questo passaggio prima che la vera ipossia per le cellule e i media inizi nel passaggio 2.5.
   1. Nel gruppo di controllo normossico, sostituire il supporto originale con mezzo normale fresco contenente glucosio e siero.
4. Umidificare la camera dell'ipossia posizionando una capsula di Petri riempita con acqua sterile all'interno della camera. Quindi, posizionare le piastre che comprendono i gruppi ipossici nella camera.
5. Lavare la camera dell'ipossia con gas ipossico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) per 5 minuti ad una portata di 30 L/min. Posizionare la camera nell'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
6. Dopo l'ipossia, coltivare CM ed EC in condizioni normali. Per fare ciò, scartare il vecchio mezzo delle piastre/inserti, sostituirlo con un mezzo normale (contenente glucosio e siero; 500 μL di ciascun pozzetto/inserto) e conservarlo nell'incubatore in condizioni normali di coltura (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) per 2 ore per imitare la riperfusione.
7. Per controllare eventuali effetti della sostituzione dei supporti, modificare il mezzo delle cellule normossiche contemporaneamente alla modifica del mezzo ipossico.
   Nota : figura 2 fornisce una panoramica schematica di questo protocollo.

3. Valutazione degli endpoint

1. Trasferire il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare 200 μL di mezzi da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e distribuire equamente in quattro pozzetti della piastra da 96 pozzetti, di conseguenza. Utilizzare una piastra ciascuno per normossia contro ipossia contro HR.
2. Determinare il grado di lesione cellulare, ad esempio, misurando l'assorbanza per LDH utilizzando un kit di analisi della citotossicità seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire il test in una piastra a 96 pozzetti come indicato nel protocollo di analisi.

4. Statistiche

1. Visualizzare i dati parametrici come deviazione media/standard e i dati non parametrici come box plot con intervallo mediano/interquartile. Dovrebbero essere eseguiti adeguati test di confronto multiplo parametrico rispetto a quelli non parametrici con test post-hoc accettabili per ridurre la possibilità di un errore di tipo 1. La significatività è in genere impostata su un alfa di 0,05 (a due code).
2. Per tutti gli esperimenti condotti nel presente studio, eseguire almeno tre ben replicati all'interno di un esperimento. C'erano da tre a sei ripetizioni di ogni esperimento utilizzato per l'analisi statistica.

Tutti e tre i tipi di inserti (A, B, C) utilizzati in questo esperimento hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L'unica differenza tra loro è l'altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente di 0,5, 1,0 e 2,0 mm (Figura 3) e che provengono da fornitori diversi (per i dettagli vedere Tabella dei materiali).

Per stabilire un modello di co-coltura in vitro con strati separati di due linee cellulari sottoposte a HR per simulare la lesione IR, abbiamo esaminato l'integrità della membrana cellulare dei CM co-coltivati con o senza EC. L'utilizzo di un inserto separato per le CE che può essere posizionato a varie distanze sopra lo strato CM ci ha permesso di valutare anche gli effetti differenziali della distanza dello strato cellulare sulla gravità del danno alla membrana nei CM. In una serie separata di esperimenti, abbiamo variato la densità delle CE e quindi il rapporto tra CE e CM. Inoltre, per differenziare l'ischemia simulata dalla lesione IR simulata, sono stati condotti esperimenti in condizioni di 1) normossia, 2) solo ipossia e 3) HR. Per questo modello, abbiamo usato ipossia di 24 ore, seguita da una riossigenazione di 2 ore.

Distanze variabili
Distanza di 0,5 mm tra gli strati di cella (Inserire A)
Quando le CM sono state coltivate da sole, l'ipossia ha portato a un aumento significativo del rilascio di LDH rispetto alla normossia, in linea con i nostri studi precedenti (Figura 4A)6. Tuttavia, l'LDH è stato solo lievemente ulteriormente aumentato dopo la riossigenazione di 2 ore rispetto al gruppo solo ipossia. Quando CE e CM sono stati co-coltivati insieme a una distanza di 0,5 mm, l'aumento del rilascio di LDH solo per ipossia non è stato attenuato indicando che le CE non hanno mostrato alcun effetto protettivo (rispetto al gruppo di CM da solo nelle condizioni di sola ipossia). Tuttavia, le CE hanno esercitato una protezione lieve ma significativa sui CM durante le risorse umane.

Distanza di 1,0 mm tra gli strati cellulari (Inserire B)
Lo stesso esperimento è stato eseguito come sopra, tranne per il fatto che la distanza tra i due strati cellulari è stata aumentata a 1,0 mm (Figura 4B). Abbiamo scoperto che il rilascio di LDH è stato anche significativamente aumentato nei CM solo per ipossia. Tuttavia, a differenza dell'inserto da 0,5 mm, l'aumento dell'LDH nel solo CM è stato potenziato dall'HR rispetto alla sola ipossia. Inoltre, questo potenziamento è stato più inibito e quasi abolito dalla presenza delle CE durante la riossigenazione rispetto al gruppo solo CM.

Distanza di 2,0 mm tra gli strati di cella (Inserisci C)
Quando sono stati utilizzati inserti di co-coltura che creano una distanza di 2,0 mm tra le due linee cellulari (Figura 4C), abbiamo anche riscontrato un aumento significativo del rilascio di LDH da parte dei CM, solo durante l'ipossia, nella stessa misura degli esperimenti da 0,5 mm e 1,0 mm. È interessante notare, tuttavia, che l'ulteriore aumento del rilascio di LDH per riossigenazione è stato ancora più pronunciato rispetto agli esperimenti da 1,0 mm. Entrambi questi aumenti sono stati attenuati, anche se non aboliti, dalla presenza di CE, il che indica che, a differenza dell'uso di inserti da 0,5 o 1,0 mm, le CE hanno protetto in modo significativo le CM da lesioni sia in condizioni di ipossia che di HR.

Intensità CE variabili
In una serie diversa di esperimenti, la concentrazione di EC placcati in inserti da 2,0 mm è stata titolata rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 celle per inserto. Il rilascio di LDH è stato misurato dopo ipossia di 24 ore seguita da una riossigenazione di 2 ore. I nostri risultati hanno mostrato che l'aumento dell'intensità ec nella co-coltura ha portato a un'attenuazione dose-dipendente del rilascio di LDH causata da HR (Figura 5); nessun effetto di questo tipo è stato osservato in condizioni normossiche.

Figura 1: Schema di inserimento all'interno del pozzo. Gli inserti con le CE (fino a 100.000 celle per inserto) vengono trasferiti alle piastre a 24 pozzetti con i CM (300.000 per pozzetto) sul fondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Progettazione sperimentale. Le cellule vengono coltivate in condizioni normali di ossigeno (21% O2) e quindi divise in due gruppi: un gruppo di controllo normossico continuerà a essere coltivato in condizioni normali per altre 24 ore, mentre il gruppo ipossia sarà coltivato in una camera ipossia per 24 ore con solo lo 0,01% di O2 e nessun glucosio. Dopo questi interventi di 24 ore, entrambi i gruppi di cellule vengono rinfrescati con i mezzi e coltivati continuamente in un ambiente del21 % O 2 per altre 2 ore, la fase di riossigenazione, prima di condurre eventualmente i test endpoint, ad esempio l'analisi LDH. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini e schemi dei tre diversi inserti. La distanza tra le cellule endoteliali nell'inserto e i cardiomiociti nella parte inferiore del pozzo può essere variata utilizzando diversi inserti. Tutti e tre i tipi di inserti utilizzati qui hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L'unica differenza tra loro è l'altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente 0,5 (A), 1,0 (B) e 2,0 mm (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto di tre tipi di inserti di coltura nella valutazione del rilascio di lattato deidrogenasi (LDH; in unità di assorbanza [au]) sotto normossica (sinistra), solo ipossia (al centro) e condizioni di ipossia/riossigenazione (destra) per i cardiomiociti da soli (CM; bianco), le cellule endoteliali da sole (EC; nero) e le co-colture di CM con EC (check pattern). (A) distanza di 0,5 mm, (B) distanza di 1,0 mm, (C) Distanza di 2,0 mm tra i due diversi strati cellulari. Le NC sono state placcate ad una densità di 100.000 celle per inserto, le CM ad una densità di 300.000 celle per pozzetto. I dati sono ± deviazione standard, n = 4 per gruppo. Statistiche: ANOVA seguito da Student-Newman-Keuls test post-hoc. P < 0,05 (a due code) indicato da barre orizzontali tra ogni coppia confrontata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Concentrazione di cellule endoteliali co-coltivate (EC; 25: 25.000 cellule per inserto; 50: 50.000 cellule per inserto; 100: 100.000 cellule per inserto) protezione dose-dipendente dei cardiomiociti (CM) contro ipossia/danno da riossigenazione (a destra) rispetto alle condizioni normossiche (a sinistra) come evidenziato dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH; in unità di assorbanza [au]). Le CE non hanno avuto alcun effetto sul rilascio di LDH in condizioni normossiche. I dati sono ± deviazione standard, n = 4 per gruppo. Statistiche: ANOVA seguito da Student-Newman-Keuls test post-hoc. P < 0,05 (a due code) indicato da barre orizzontali tra ogni coppia confrontata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.