Summary

Colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata di quattro tipi di cellule immunitarie endometriali in aborto spontaneo ricorrente

Published: August 04, 2021
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Summary

Nonostante i progressi nell’immunoistochimica multiplex e nell’imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell’endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l’imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell’endometrio.

Abstract

L’immunoistochimica è il metodo più comunemente usato per l’identificazione e la visualizzazione degli antigeni tissutali nella ricerca biologica e nella diagnostica clinica. Può essere utilizzato per caratterizzare vari processi biologici o patologie, come la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, il rigetto dei tessuti e le interazioni tessuto-biomateriale. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione di più antigeni (specialmente per le cellule immunitarie) in una singola sezione di tessuto utilizzando la colorazione immunoistochimica convenzionale (IHC) rimane insoddisfacente. Pertanto, negli ultimi anni sono state introdotte tecnologie multiplexed per identificare più marcatori biologici in un singolo campione di tessuto o in un insieme di diversi campioni di tessuto.

Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per differenziare i cambiamenti nelle interazioni immuno cellula-cellula all’interno dell’endometrio tra donne fertili e donne con aborti ricorrenti durante l’impianto. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la colorazione IHC a fluorescenza multiplexata per studiare la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie contemporaneamente in campioni endometriali temporizzati con precisione durante l’impianto dell’embrione. Il metodo prevede la preparazione del campione, l’ottimizzazione multiplex con marcatori per i sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall’analisi dei dati, con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali.

Utilizzando questo metodo, la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie nell’endometrio possono essere analizzati simultaneamente in una singola sezione di tessuto. Inoltre, questo documento discuterà i fattori critici e la risoluzione dei problemi per superare possibili interferenze fluoroforiche tra le sonde fluorescenti applicate. È importante sottolineare che i risultati di questa tecnica di colorazione multiplex possono aiutare a fornire una comprensione approfondita dell’interazione immunologica e della regolazione durante l’impianto dell’embrione.

Introduction

L’aborto spontaneo ricorrente (RM) può essere definito come la perdita di due o più gravidanze prima delle 24 settimane digestazione 1. Questa condizione riproduttiva frequente colpisce fino all’1% delle coppie in tutto il mondo2,3. La fisiopatologia è multifattoriale e può essere suddivisa in cause embriologicamente guidate (principalmente a causa di un cariotipo embrionale anormale) e cause guidate dalla madre che influenzano lo sviluppo dell’endometrio e / o della placenta. Questa manifestazione può derivare da anomalie genetiche parentali, anomalie uterine, condizioni protrombotiche, fattori endocrinologici e disturbi immunologici4.

Negli ultimi anni, la disfunzione delle cellule effettrici immunitarie è stata implicata nella patogenesi della perdita precoce della gravidanza5. Ciò ha ispirato molte indagini per chiarire le popolazioni specifiche di cellule immunitarie nell’endometrio durante il ciclo mestruale, l’impianto e la gravidanza precoce, con ruoli specifici all’inizio della gravidanza. Tra queste cellule immunitarie, le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale durante l’impianto dell’embrione e la gravidanza, in particolare nei processi di invasione trofoblastica e angiogenesi6. Gli studi hanno dimostrato un aumento della densità delle cellule uNK nell’endometrio delle donne con RM7,8, anche se questo risultato non è stato associato ad un aumentato rischio di aborto spontaneo9. Tuttavia, questo ha stimolato la ricerca valutando la densità di altri tipi di cellule immunitarie (come macrofagi, cellule dendritiche uterine) nell’endometrio nelle donne con RM10,11. Tuttavia, rimane incerto se vi sia un’alterazione significativa della densità delle cellule immunitarie nell’endometrio perimpianto nelle donne con RM.

Una possibile spiegazione per l’incertezza è che la valutazione della densità delle cellule immunitarie endometriali potrebbe essere difficile a causa dei rapidi cambiamenti nell’endometrio durante la finestra di impianto. Durante il lasso di tempo di 24 ore, cambiamenti significativi nell’endometrio alterano la densità delle cellule immunitarie e la secrezione di citochine, introducendo una fonte di variazione in questi risultati12. Inoltre, la maggior parte dei rapporti si basa principalmente sull’uso della colorazione a singola cellula (ad esempio, metodi IHC tradizionali) che non potrebbero esaminare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Sebbene la citometria a flusso possa essere utilizzata per rilevare più popolazioni cellulari in un singolo campione, le grandi quantità di cellule richieste e l’ottimizzazione dispendiosa in termini di tempo ostacolano la popolarità e l’efficienza di questo metodo. Quindi, il recente progresso nella colorazione IHC multiplex potrebbe risolvere questo problema immunocolorando più marcatori sullo stesso vetrino per valutare più parametri, tra cui il lignaggio cellulare e la localizzazione istologica delle singole sottopopolazioni immunitarie. Inoltre, questa tecnologia può massimizzare le informazioni ottenute in caso di limitata disponibilità di tessuti. In definitiva, questa tecnica può aiutare a chiarire le differenze nelle interazioni delle cellule immunitarie nell’endometrio tra donne fertili e donne con RM.

Due gruppi di donne sono stati reclutati dal Prince of Wales Hospital, tra cui donne fertili di controllo (FC) e donne con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile (RM). Il controllo fertile è stato definito come le donne che hanno avuto almeno un parto vivo senza alcuna storia di aborto spontaneo, e le donne RM sono state definite come quelle che hanno avuto una storia di ≥2 aborti consecutivi prima di 20 settimane di gestazione. I soggetti dei due gruppi soddisfacevano i seguenti criteri di inclusione: (a) età compresa tra 20 e 42 anni, (b) non fumatore, (c) ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e struttura uterina normale, (d) nessun uso di alcun regime ormonale per almeno 3 mesi prima della biopsia endometriale, (e) nessun idrosalpinx mediante istero-salpingogramma. Inoltre, tutti i soggetti reclutati avevano cariotipo normale, isterosalpingogramma ecografico a 3 dimensioni normale, ormone follicolo-stimolante del giorno 2 30 nmol / L, normale funzione tiroidea e risultati negativi per gli anticorpi anticoagulante lupus e anticardiolipinA IgG e IgM.

Per comprendere meglio le basi immunologiche della RM, sarebbe più auspicabile quantificare e localizzare contemporaneamente i principali tipi di cellule immunitarie presenti nell’endometrio al momento dell’impianto. Questo articolo descrive l’intero protocollo dalla preparazione del campione, l’ottimizzazione multiplex con marcatori per sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall’analisi dei dati con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. Inoltre, questo documento descrive come determinare la densità e il raggruppamento dei tipi di cellule immunitarie contemporaneamente nell’endometrio.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali. Fare riferimento alla sezione introduttiva per i criteri di inclusione dei gruppi di controllo e RM. 1. Preparazione del campione Assicurarsi che tutte le donne in questo studio siano sottoposte a un test giornaliero dell’astina delle urine dal gior…

Representative Results

Il processo schematico complessivo di esecuzione di un test multiplex a 4 colori per il rilevamento di 4 tipi di cellule immunitarie endometriali è mostrato nella Figura 1. In breve, il protocollo per questa colorazione di immunofluorescenza multiplex ha richiesto 8 passaggi chiave: 1. Preparazione del vetrino, 2. Recupero dell’epitopo, 3. Blocco, 4. Applicazione dell’anticorpo primario, 5. Applicazione dell’anticorpo secondario, 6. Amplificazione del segnale, 7. Rimozione dell’anticorpo e …

Discussion

Passaggi critici all’interno del protocollo
È importante notare che la colorazione multiplex richiede un’ottimizzazione diligente. Il recupero dell’antigene, utilizzando il tampone citrato e la tecnologia a microonde, richiede l’ottimizzazione per garantire la completa rimozione degli anticorpi e mantenere la vitalità dei tessuti. Poiché i reagenti TSA si legano covalentemente ai siti che circondano l’antigene, possono potenzialmente inibire il legame di un successivo anticorpo primario attraverso …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato dall’Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund nel 2018 e dall’Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Materials

Amplification Diluent Perkin Elmer FP1498 Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent Perkin Elmer ARD1001EA Diluting the antibody
CD3 Spring Bioscience M3072 Primary antibody
CD20 Biocare Medical CM004B Primary antibody
CD56 Leica NCL-CD56-504 Primary antibody
CD68 Spring Bioscience M5510 Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) Abcam AB64214 Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture) Merck 108297 Dewaxing
Ethanol absolute Merck 107017 Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome Leica RM2125RTS Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software Perkin Elmer inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) Data Analysis software
Mantra® Workstation Akoya Biosciences CLS140089 Spectral imaging
Microwave Panasonic Inverter Microwave stripping
Opal 520 Perkin Elmer FP1487A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620 Perkin Elmer FP1495A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650 Perkin Elmer FP1496A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690 Perkin Elmer FP1497A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven Memmert U10 Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum Perkin Elmer ARH1001EA Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant ThemoFisher Scientific P36930 Mounting
Spatstat / Version 2.1-0 Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI Perkin Elmer FP1490A Nucleic acid staining
Tissue Processor Thermo Fischer Excelsior ES Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x Cell Signaling Technology 12498S Washing solution
Tween 20 Sigma-Aldrich P1370-1L Nonionic detergent

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zhao, Y., Man, G. C. W., Chan, L. K. Y., Guo, X., Liu, Y., Zhang, T., Kwong, J., Wang, C. C., Chen, X., Li, T. C. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage. J. Vis. Exp. (174), e62931, doi:10.3791/62931 (2021).

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