Monitoraggio in tempo reale della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane graduate differenziate con citochine

Il corretto sviluppo e la funzione delle cellule T sono essenziali per la capacità del sistema immunitario di riconoscere e rispondere agli antigeni. La fosforilazione ossidativa mitocondriale (OxPhos) cambia in base allo stato della cellula T. Le cellule T naïve utilizzano prevalentemente OxPhos per produrre ATP, mentre le cellule T attivate subiscono una transizione metabolica in cui la glicolisi diventa ^dominante1. Dopo la fase effettrice, il piccolo sottoinsieme rimanente di cellule T di memoria ritorna ad uno stato metabolico dominato da OxPhos2,3. I cambiamenti di OxPhos seguono la differenziazione delle cellule T a tal punto che anche sottoinsiemi di cellule T possono essere differenziati dalle loro proprietà specifiche di OxPhos1. Al contrario, OxPhos è importante per la funzione delle cellule T e l'inibizione di OxPhos ha dimostrato di bloccare la proliferazione e la produzione di citochine delle cellule ^T4. Pertanto, la capacità di quantificare le proprietà delle cellule T OxPhos in modo preciso e riproducibile è uno strumento potente per chiunque lavori con le cellule T.

In questo protocollo, le proprietà delle cellule T OxPhos sono misurate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. La funzione principale di questo analizzatore è quella di misurare continuamente il contenuto di ossigeno dei mezzi di crescita delle cellule da analizzare. Si presume che l'ossigeno rimosso dai mezzi di crescita sia assorbito dalle cellule. Trattando le cellule con una varietà di inibitori o modificatori di OxPhos, un calo dell'assorbimento di ossigeno è associato alla funzione inibita o modulata. Ad esempio, l'inibizione dell'ATP sintasi porterà ad un ridotto assorbimento cellulare di ossigeno che altrimenti verrebbe utilizzato per produrre ATP mediante fosforilazione ossidativa. Altre apparecchiature, tra cui l'elettrodo Clark e lo strumento Oroboros, offrono funzionalità simili e ogni strumento presenta vantaggi e carenze diversi. Una vasta gamma di tipi di cellule può essere utilizzata per studi in questi dispositivi, ma un tipo di cellula particolarmente impegnativo sono i linfociti T primari ^umani5. A causa delle loro piccole dimensioni, della scarsa sopravvivenza ex vivo e delle proprietà non aderenti, le cellule T primarie umane possono essere difficili da studiare.

Questo è un protocollo per studiare la respirazione mitocondriale delle cellule T primarie umane mediante un analizzatore extracellulare. Il protocollo è diviso in una corsa di ottimizzazione, in cui vengono determinate le concentrazioni ottimali di numero di cellule per pozzo, nonché la concentrazione ottimale di oligomicina e FCCP. Inoltre, viene eseguito un test, in cui vengono utilizzate le condizioni ottimizzate.

Utilizzando PBMC umane derivate dal sangue e colture di cellule T primarie ex vivo , questo protocollo dimostra l'importanza della concentrazione ottimale di inibitori e la rilevanza dell'uso separato anziché di un'iniezione sequenziale di inibitori mitocondriali quando si lavora con tipi di cellule sensibili. Infine, è dimostrato che questo test può rilevare in modo robusto sottili differenze nella respirazione mitocondriale dopo polarizzazione con citochine IL-2 e IL-15.

Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida dell'ospedale Herlev e della regione della capitale della Danimarca.

NOTA: questo protocollo contiene istruzioni sia per un'esecuzione di ottimizzazione che per un'esecuzione di test. È chiaramente scritto nel testo quando le istruzioni sono per un'esecuzione di ottimizzazione o un'esecuzione di analisi. Eseguire un'esecuzione di ottimizzazione prima di continuare con le esecuzioni di analisi

1. Isolamento mononucleato del sangue periferico umano (PBMC) da buffy coats

1. Isolamento PBMC
   1. Raccogli i cappotti buffy dall'istituzione appropriata (raccolti in sacche di raccolta del sangue). I cappotti Buffy provengono da donatori sani. Escludere i donatori che hanno recentemente utilizzato antidolorifici.
   2. Spruzzare la sacca per la raccolta del sangue contenente il buffy coat con il 70% di etanolo prima di trasferirla in un armadio a flusso laminare. Utilizzare sempre tecniche sterili e hardware sterile per tutti i passaggi
      NOTA: Assicurarsi che siano ottenute le autorizzazioni corrette per la manipolazione dei campioni di sangue umano.
   3. Trasferire il sangue in un tubo centrifugo sterile da 50 ml.
   4. Diluire il sangue di almeno il 10% con RPMI 1640 non integrato.
   5. Versare 20 mL del mezzo gradiente di densità preferito in un tubo centrifuga da 50 mL.
   6. Aspirare 25 ml di sangue diluito in una pipetta sierologica. Impostare il controller della pipetta elettrica alla velocità più bassa.
   7. Tenere il tubo con gradiente di densità medio ad un angolo di 45° e appoggiare la punta della pipetta sierologica sul lato interno del tubo centrifuga da 50 mL. Rilasciare lentamente 25 ml di sangue diluito dalla pipetta sierologica.
   8. Assicurarsi che il sangue diluito e il mezzo del gradiente di densità non si mescolino. Assicurarsi che il sangue diluito riposi sopra il mezzo del gradiente di densità.
   9. Ripetere questa operazione con i successivi tubi medi a gradiente di densità fino a quando tutto il sangue diluito non viene elaborato.
   10. Spostare con attenzione i tubi in una centrifuga e centrifuga a 1000 x g per 30 minuti in un rotore swing-out a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che l'accelerazione e la rottura siano al minimo.
       NOTA: Dopo la centrifugazione, dovrebbero essere visibili vari strati. Lo strato superiore, chiaro da rosa ad arancione, è costituito dal plasma sanguigno e dalle piastrine. Lo strato bianco medio è costituito dai PBMC seguiti da uno strato chiaro costituito dal mezzo gradiente di densità e infine da uno strato rosso scuro nella parte inferiore con globuli rossi.
   11. Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, aspirare accuratamente lo strato bianco contenente PBMC in un tubo centrifugo da 50 ml.
       NOTA: assicurarsi di non trasferire il mezzo del gradiente di densità in quanto ciò influirà sulla purificazione a valle. L'eccesso di plasma non influenzerà i risultati.
   12. Raggruppare tutti i PBMC raccolti nello stesso tubo centrifugo da 50 mL e rabboccare fino a 50 mL con RPMI 1640.
   13. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a RT (eseguire le restanti fasi di centrifugazione a questa impostazione se non diversamente specificato).
   14. Aspirare il surnatante e risospendere le celle in 30 ml di RPMI 1640. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
   15. Per la crioconservazione, sospendere un massimo di 30 milioni di cellule per 1 mL di terreno di congelamento.
   16. Trasferire le cellule su criotubi e congelare fino a -80 °C utilizzando un contenitore di congelamento a velocità controllata (-1 °C al minuto). Per la conservazione a lungo termine, spostare i PBMC a -140 °C.
       NOTA: limitare il tempo in cui le celle si trovano nel mezzo di congelamento in CORRISPONDENZA DI RT. A RT, DMSO è altamente tossico per le cellule.

2. Coltivazione di linfociti T primari umani attivati

1. Scongelamento delle cellule (Giorno 1)
   1. Preriscaldare 10 mL di RPMI 1640 per campione a circa 37 °C.
   2. Prendere il numero desiderato di fiale cellulari e conservarle temporaneamente su ghiaccio secco.
   3. Risospendare le celle congelate in 10 ml di RPMI 1640 preriscaldato.
   4. Centrifugare le celle per 5 min a 500 x g a RT.
   5. Scartare il surnatante e lavare nuovamente le celle riesempendo in 10 ml di RPMI 1640 e centrifugando come descritto al punto 2.1.4.
   6. Scartare il surnatante e risospese le cellule a 2 x ¹⁰⁶ cellule per mL di X-VIVO 15 medio + 5% siero umano (di seguito: mezzo di cellule T).
   7. Piastra 2 mL delle cellule per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti e incubare durante la notte a 37 °C e 5% di _CO2.
2. Attivazione delle cellule (Giorno 0)
   1. Lavare le perle CD3/CD28 trasferendo 12,5 μL di perline per 1 milione di cellule a un tubo microcentrifuga. Aggiungere 12,5 μL di PBS per 12,5 μL di perline.
      NOTA: È importante ruotare il flaconcino di perline prima dell'uso.
   2. Posizionare il tubo della microcentrifuga su un magnete adatto per 1 minuto.
   3. Scartare il tampone e risospendere le perline nel volume originale del mezzo delle cellule T (12,5 μL di mezzo cellulare T per 12,5 μL del volume originale di perline).
   4. Aggiungere 12,5 μL di perline per milione di cellule corrispondenti ad un rapporto di 1:2 (perline: cellule).
   5. Dividere le cellule in due condizioni con circa 5 milioni di cellule in ciascuna.
   6. Aggiungere il volume corretto di citochine alle condizioni menzionate nella Tabella 1.
   7. Incubare le cellule per 3 giorni a 37 °C e 5% di _CO2.
3. Coltivazione di cellule (Giorno 3 e 5)
   1. Risospesce le celle e dividetele trasferendo metà del volume da ciascun pozzo in un nuovo pozzo. Aggiungere lo stesso volume di mezzo cellulare T fresco a ciascun pozzetto.
   2. Aggiungere nuove citochine a ciascuna condizione come menzionato nella Tabella 1.

3. Saggio del flusso extracellulare

1. Idratazione della cartuccia del sensore (Giorno 0)
   1. Disimballare la cartuccia del sensore e rimuovere con cura la cartuccia del sensore dalla piastra dell'utilità.
   2. Posizionare la cartuccia del sensore capovolta, facendo attenzione a non toccare le sonde del sensore.
   3. Riempire la piastra di utilità con 200 μL di calibrante (vedere Tabella dei materiali per i dettagli) e sostituire con attenzione la cartuccia del sensore nella piastra di utilità.
   4. In alternativa, per eliminare qualsiasi formazione di bolle, incubare la cartuccia del sensore in acqua ultrapura sterile durante la notte e sostituirla con un calibrante preriscaldato la mattina del test.
   5. Incubare la piastra della cartuccia del sensore a 37 °C in un armadio di riscaldamento non regolato da _CO2 durante la notte.
      NOTA: è molto importante utilizzare un armadio non regolato da _CO2 poiché l'eccesso di _CO2 influenzerà la cartuccia del sensore. Assicurarsi che l'analizzatore di flusso (vedere Tabella dei materiali per i dettagli) sia acceso almeno un giorno prima dell'uso per consentirgli di riscaldarsi fino a 37 °C.
2. Rivestimento cellulare e preparazione di inibitori mitocondriali (Giorno 1)
   1. Preparare una soluzione di rivestimento (vedere Tabella dei materiali) contenente NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) e NaOH (1,0 M, 24 μL).
      NOTA: La soluzione di rivestimento deve essere sempre fatta e utilizzata fresca.
   2. Aprire una piastra di coltura cellulare XF fresca e aggiungere 12 μL della soluzione di rivestimento appena preparata a ciascun pozzetto. Garantire una distribuzione uniforme della soluzione di rivestimento sul fondo di tutti i pozzetti.
   3. Incubare la piastra a RT con il coperchio acceso per 30 minuti ed eliminare la soluzione liquida rimanente da tutti i pozzetti.
   4. Lavare la piastra con 200 μL di acqua sterile ed eliminare il liquido.
   5. Lavare la piastra con 200 μL di PBS sterile di grado di coltura cellulare ed eliminare il liquido.
   6. Lasciare il piatto a RT e lasciarlo asciugare per almeno 30 minuti.
3. Cellule T della piastra nella piastra di coltura cellulare XF (Giorno 1)
   1. Preparare 50 mL di mezzi di saggio mescolando i mezzi XF RPMI adatti con glucosio, piruvato e glutammina secondo la configurazione sperimentale (livelli raccomandati: 4 mM di glucosio, 1 mM di piruvato e 3 mM di glutammina).
   2. Riscaldare a 37 °C in un incubatore non regolato a _CO2 e impostare il pH a 7,4. Assicurarsi che vi siano mezzi sufficienti per la placcatura delle cellule e la preparazione di oligomicina e soluzioni FCCP (paragrafo 3.4).
   3. Progettare un layout di piastra con un numero crescente di celle per pozzetto per l'esecuzione dell'ottimizzazione o l'esecuzione del test. Utilizzare quattro pozzi 4, riempiti con supporti e iniettati con supporti, per le misurazioni di fondo.
   4. Contare le cellule T preparate nel paragrafo 2.3 (con il metodo preferito) e pipettare il numero corretto di celle per ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare XF rivestita con la soluzione di rivestimento, secondo il layout della piastra.
      NOTA: Il volume finale di ciascun pozzetto può variare ma deve essere sufficiente a coprire il fondo del pozzo.
   5. Centrifugare la piastra di coltura cellulare XF a 1000 x g a RT per 10 minuti per far aderire la cellula T alla superficie rivestita.
   6. Lavare le cellule con 200 μL di mezzi di analisi, scartare il fluido e aggiungere 180 μL di mezzi di analisi.
      NOTA: ispezionare visivamente i pozzetti utilizzando un microscopio a luce invertita per assicurarsi che le cellule siano attaccate e distribuite uniformemente sulla superficie del pozzo.
   7. Incubare la piastra di coltura cellulare XF nell'armadio di riscaldamento non regolato da _CO2 per 30 minuti per garantire che la temperatura della piastra sia di 37 °C.
4. Cartuccia sensore di carico con oligomicina e FCCP per l'ottimizzazione (Giorno 1)
   NOTA: Se le concentrazioni di oligomicina e FCCP sono già state ottimizzate, continuare al paragrafo 3.5.
   1. Preparare soluzioni di lavoro di oligomicina e FCCP in mezzi di saggio (preparati nella fase 3.3.1) come descritto nei passaggi 3.4.2 e 3.4.3.
   2. Soluzioni di lavoro di oligomicina: preparare una soluzione da 5 μM (2 mL di mezzi di saggio + 10 μL di 1 mM di oligomicina) e una soluzione da 3 μM (8 mL di mezzi di saggio + 24 μL di 1 mM di stock di oligomicina).
   3. Soluzione di lavoro FCCP: Preparare una soluzione da 2 μM (2 mL di mezzo di saggio + 13,2 μL di 300 μM FCCP di stock) e una soluzione da 1,3 μM (8 ml di mezzi di saggio + 34,6 μL di 300 μM FCCP stock)
   4. Caricare le soluzioni di lavoro di oligomicina o FCCP nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore (Tabella 2).
      NOTA. È importante che nessuna porta di iniezione contenga solo aria. Se, per qualsiasi motivo, non vengono utilizzate tutte le porte di iniezione, le porte vuote devono essere riempite con supporti di analisi.
   5. Battere delicatamente i bordi della piastra sul tavolo per rimuovere potenziali bolle nelle porte di iniezione.
5. Cartuccia del sensore di carico con oligomicina, FCCP e antimicina A per il test (Giorno 1)
   1. Preparare soluzioni di oligomicina, FCCP in mezzi di analisi (preparati nella fase 3.3.1) in base alle concentrazioni ottimali identificate in una precedente esecuzione di ottimizzazione. Inoltre, preparare una soluzione di antimicina A da 20 μM.
   2. Caricare 20 μL di oligomicina o FCCP nella porta di iniezione A della cartuccia del sensore in base al layout della piastra. Aggiungere 22 μL di 20 μM di antimicina A alla porta di iniezione B di tutti i pozzetti. La concentrazione risultante di antimicina A una volta iniettata nel pozzo sarà di 2 μM.
6. Impostazione del protocollo sperimentale nel software di analisi Flux.
   1. Assegnare i gruppi e la mappa della piastra per ogni condizione per layout della piastra.
   2. Progettare il protocollo in base alla strategia di iniezione (Tabella 3 e Figura 1).
      NOTA: durante l'esecuzione di Assay, l'iniezione C e D può essere omessa.
   3. Salvare la configurazione del test, compilare le informazioni necessarie per l'inclusione per il test e premere Start.
   4. L'analizzatore di flusso richiederà la cartuccia del sensore preparata nel paragrafo 3.5. Rimuovere il coperchio e inserire la cartuccia del sensore come indicato dall'analizzatore.
      NOTA: il test calibra e controlla i sensori indicati da segni di spunta. Dopo una calibrazione riuscita, l'analizzatore richiederà la piastra di coltura cellulare XF preparata nel paragrafo 3.3. La piastra di utilità viene espulsa dall'analizzatore e sostituita con la piastra di coltura cellulare XF per avviare il test.

Una corretta determinazione delle proprietà di OxPhos è uno strumento indispensabile quando si studiano le cellule T. Tuttavia, se le condizioni del test non sono state ottimizzate, vi è un rischio sostanziale di risultati fuorvianti o errati. In questo protocollo, c'è una forte attenzione all'ottimizzazione del numero di cellule per pozzo e alle concentrazioni di oligomicina e FCCP da utilizzare. Nella configurazione descritta, oligomicina e FCCP vengono aggiunti in modo incrementale allo stesso pozzo, aumentando la concentrazione dei modulatori mitocondriali. La concentrazione ottimale di oligomicina e FCCP può essere determinata dalle curve OCR risultanti dei pozzi come la concentrazione in cui viene raggiunto un plateau.

Nella corsa rappresentativa, l'oligomicina viene aggiunta in una concentrazione crescente e inibisce l'ATP sintasi (Complesso V della catena di trasporto degli elettroni), con conseguente diminuzione della respirazione mitocondriale. Un plateau in OCR viene raggiunto dopo che la concentrazione accumulativa dei pozzi ha raggiunto 1 μM. Da questa concentrazione e dall'aumento delle concentrazioni l'OCR non è stato ulteriormente ridotto (Figura 1A). Per i pozzetti trattati con una concentrazione incrementale del disaccoppiatore FCCP, i livelli di OCR sono aumentati come previsto fino a raggiungere un plateau dopo l'aggiunta di 0,2 μM di FCCP, indicando che a questa concentrazione è stato ottenuto il disaccoppiamento completo (Figura 1B). Un'ottimizzazione delle cellule placcate per pozzetto è importante per un saggio corretto e riproducibile. Se il numero di cellule utilizzato è troppo basso, il livello di ossigeno rimosso dal mezzo di analisi dalle cellule è troppo basso per essere misurato correttamente dall'analizzatore. D'altra parte, se il numero di cellule per pozzo è troppo alto, il consumo di ossigeno delle cellule può diventare così alto che il sistema non può reintegrare i livelli di ossigeno del mezzo di saggio dopo ogni misurazione, portando a un ambiente sempre più ipossico e a una caratterizzazione errata di OxPhos.

Nella corsa rappresentativa, le cellule sono state seminate ad una densità di 200.000 e 400.000 cellule per pozzetto (Figura 2A-C). Per una corsa con 200.000 celle, l'OCR iniziale è circa la metà di una corsa con 400.000 celle per pozzetto. Per il trattamento FCCP, l'OCR massimo è 61,6 pmol/min (200.000 cellule) contro 190,4 pmol/min (400.000 cellule). Dopo il trattamento con oligomicina, l'OCR in esecuzione con 200.000 cellule collassa in OCR a una cifra (6,4 pmol / min). Questo è inferiore all'OCR della corsa, con 400.000 cellule per pozzo trattate con oligomicina (25,8 pmol / min, rispettivamente).

Pertanto, dall'esecuzione dell'ottimizzazione, è chiaro che è stato richiesto un numero di celle di 400.000 cellule per pozzo per test futuri, utilizzando 1 μM di oligomicina e 0,2 μM FCCP. Nella configurazione classica raccomandata dal produttore, l'oligomicina e la FCCP vengono aggiunte in sequenza con l'aggiunta finale di antimicina A. Per le cellule T, questo non è l'approccio ottimale in quanto il trattamento con oligomicina può essere visto per limitare il disaccoppiamento dopo il trattamento FCCP (Figura 3A, B). In questo metodo presentato, si raccomanda di eseguire ogni condizione in pozzetti duplicati e trattare un pozzo con oligomicina e l'altro con FCCP, con un'aggiunta finale di antimicina A per entrambi i pozzetti. Utilizzando questo approccio, il trattamento con oligomicina non influisce sull'OCR dopo il trattamento con FCCP. Questo approccio consente di determinare le stesse proprietà mitocondriali del setup classico, in cui i farmaci vengono aggiunti in sequenza (Figura 3C)

Infine, è stato studiato se gli effetti delle citochine IL-2 e IL-15 potessero essere differenziati sul metabolismo delle cellule T primarie umane coltivate ex vivo. In effetti, le cellule coltivate con IL-15 possedevano una respirazione massima più elevata e una capacità respiratoria di riserva, come è stato dimostrato in precedenza1 (Figura 4A-E). La respirazione basale e la produzione di ATP non sono state influenzate. Nel loro insieme, questi dati mostrano che la respirazione mitocondriale di cellule T primarie umane coltivate ex vivo può essere analizzata con successo utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare.

Figura 1: Tasso di consumo di ossigeno (OCR) misurato durante la titolazione degli inibitori oligomicina e FCCP in cellule T primarie umane coltivate ex vivo . (A) OCR durante la titolazione graduale di oligomicina da 0-1,25 μM concentrazione finale. (B) OCR durante la titolazione graduale di FCCP da 0-0,5 μM di concentrazione finale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'influenza della concentrazione cellulare sulle misurazioni OCR in cellule T primarie umane coltivate ex vivo . Misurazioni OCR di cellule T primarie umane in coltura ex vivo con 200.000 o 400.000 cellule per pozzetto dopo iniezione di (A) FCCP o (B) Oligomicina. (C) Respirazione basale, respirazione massima, produzione di ATP e capacità respiratoria di riserva delle cellule T primarie umane utilizzando 200.000 o 400.000 cellule per pozzetto. Rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Iniezione singola o sequenziale di modulatori mitocondriali. (A) Misurazioni OCR rappresentative durante il basale e dopo l'iniezione di oligomicina e FCCP (a,b), o antimicina A (c) come singole iniezioni o come iniezioni sequenziali. (B) Valori di OCR prima dell'iniezione (respirazione basale) o dopo iniezione di oligomicina o FCCP come iniezioni singole o iniezioni sequenziali. (C) Rappresentazione schematica della strategia di iniezione e misurazione. Rappresentante di un esperimento indipendente Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenze nella respirazione mitocondriale nelle cellule T primarie umane differenziate con citochine. (A-D) Respirazione basale, respirazione massima, produzione di ATP e capacità respiratoria di riserva delle cellule T primarie umane coltivate con IL-2 o IL-15 per sette giorni (n = 3). (E) Trame rappresentative di (A-D), con iniezioni di oligomicina o FCCP (a) o antimicina A (b). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione di colture di citochine utilizzate per guidare i cambiamenti metabolici nelle cellule T.

Tabella 2: Strategia per la preparazione di inibitori e modulatori mitocondriali. Concentrazioni di preparazione, concentrazioni di lavoro e strategie di iniezione per una corsa di ottimizzazione.

Tabella 3: Progettazione del protocollo di una corsa di ottimizzazione con titolazione di inibitori mitocondriali e modulatori utilizzando 4 iniezioni con 3 misurazioni in ciascuna.

Tabella 4: Spiegazione dei vari componenti della respirazione mitocondriale studiati utilizzando l'analizzatore di flusso

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.