Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Introduzione alla tecnica
I saggi basati su colture ex vivo sono uno strumento sempre più utilizzato per la medicina di precisione e lo studio della fisiopatologia della malattia. La coltura cellulare primaria dell'epitelio nasale umano (HNE) è stata utilizzata in numerosi studi sulla fibrosi cistica ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13} , una malattia autosomica recessiva che colpisce la funzione delle cellule epiteliali in più organi. La coltura HNE fornisce una fonte rinnovabile di epiteli delle vie aeree che possono essere ottenuti in modo prospettico e ricapitola le qualità elettrofisiologiche e biochimiche per testare l'attività del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Le cellule HNE possono essere campionate con effetti collaterali minimi¹⁴, simili ai comuni tamponi respiratori virali. Il lavoro di ricerca che descrive un modello per lo studio della fibrosi cistica derivato da biopsie del pennello HNE è stato recentemente pubblicato^11,13. Mentre simile ad altri modelli che utilizzano HNE^{primario 2,3} e tessuto intestinale 15,16,17,18,19, la caratterizzazione dettagliata della differenziazione e dell'imaging di questo modello sono descritte qui per l'uso nella ricerca CF e per aiutare negli studi di altre malattie delle vie aeree¹³ . Il modello organoide non è illimitato come le linee cellulari immortalizzate, ma può essere espanso mediante riprogrammazione condizionale (utilizzando fibroblasti di alimentazione irradiati e inattivati e inibitori della Rho-chinasi) a uno stato più simile alle cellule staminali 20,21,22,23. L'elaborazione di biopsie a pennello HNE utilizzando questo metodo produce un gran numero di cellule epiteliali da utilizzare in più applicazioni a un throughput più elevato, pur mantenendo la capacità di differenziarsi completamente. Mentre questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule di alimentazione, altre metodologie possono essere utilizzate dagli investigatori che desiderano evitare la tecnologia delle cellule di alimentazione^14,24.

Importanza della tecnica per la biologia polmonare
Uno studio significativo è stato dedicato alla comprensione di come l'assenza di CFTR regolare e funzionante nella membrana cellulare delle cellule epiteliali provoca disfunzioni nei polmoni, nel pancreas, nel fegato, nell'intestino o in altri tessuti. Il trasporto ionico epiteliale disfunzionale, in particolare quello di cloruro e bicarbonato, provoca una diminuzione del volume dei fluidi di rivestimento epiteliale e cambiamenti nelle secrezioni mucose, portando a stasi e ostruzione mucosa. In altre malattie delle vie aeree, come la discinesia ciliare primaria, il movimento ciliare alterato compromette la clearance mucociliare e porta alla stasi mucosa e all'ostruzione²⁵. Pertanto, l'attuale modello di organoide HNE è stato sviluppato per varie applicazioni, a seconda del design sperimentale e delle risorse dello sperimentatore. Ciò include l'imaging di cellule vive utilizzando macchie di cellule vive; fissazione e sezionamento per caratterizzare la morfologia; colorazione immunofluorescenza con anticorpi e imaging confocale a montaggio intero per evitare di interrompere le strutture intraluminali; e imaging a campo luminoso e tomografia a coerenza micro-ottica per misure quantitative della frequenza del battito ciliare e del trasporto mucociliare¹³. Per facilitare l'espansione ad altri ricercatori, sono stati utilizzati reagenti e forniture disponibili in commercio per la coltivazione. È stato sviluppato un test funzionale che utilizzava tecniche di microscopio comuni e attrezzature più specializzate. Nel complesso, mentre il presente modello è stato progettato per valutare l'attività della CFTR al basale o in risposta alle terapie, le tecniche descritte in questo protocollo possono essere applicate ad altre malattie che coinvolgono la funzione delle cellule epiteliali, in particolare il trasporto di fluido cellulare epiteliale.

Confronto con altre metodologie
Recentemente l'utilità di questo modello organoide è stata sviluppata correlando le risposte in vitro del modulatore CFTR degli organoidi dei pazienti con la loro risposta clinica¹¹. In particolare, è anche dimostrato che il modello attuale è parallelo alle risposte di corrente di cortocircuito, l'attuale gold standard per la valutazione della funzione CFTR, negli stessi pazienti. La corrente di cortocircuito differisce dal saggio di rigonfiamento perché il primo misura la funzione CFTR tramite il trasporto^{ionico 26}. Al contrario, questo test misura un effetto più a valle con il trasporto del fluido, fornendo ulteriori informazioni sulla funzione complessiva di CFTR 27,28,29,30,31,32. Le misurazioni della corrente di cortocircuito hanno continuato ad essere un metodo comune e affidabile per determinare l'attività^del canale del cloruro CFTR ^1,33. Questi saggi elettrofisiologici richiedono attrezzature specializzate e costose, richiedono molte volte più celle per ogni replica sperimentale rispetto al saggio organoide, non possono essere facilmente automatizzati e non sono suscettibili di scalabilità per applicazioni a produttività più elevata. Un altro modello organoide derivato dagli epiteli intestinali ha ulteriori vantaggi 15,16,17,18, come una più eccellente capacità replicativa, ma non è né derivato da un tessuto delle vie aeree né è universalmente disponibile. Le spazzolature HNE sono ottenute con spazzole citologiche economiche senza la necessità di sedazione e con un rischio minimo. Ottenere la spazzolatura non richiede un medico e può essere eseguita da coordinatori di ricerca addestrati e altro personale di ricerca¹⁴. Il modello organoide HNE può essere coltivato da qualsiasi laboratorio con capacità di coltura cellulare primaria e alcune delle applicazioni possono essere eseguite con tecniche di microscopia standard. Complessivamente, questi vantaggi forniscono un ulteriore accesso alla tecnologia per valutare la funzione epiteliale delle vie aeree che altrimenti potrebbe non essere disponibile per alcuni laboratori. Inoltre, gli organoidi HNE possono essere utilizzati per studiare altri stati patologici che colpiscono le vie aeree, come la discinesia ciliare primaria²⁵ o l'infezione virale, che gli organoidi intestinali non possono.

I campioni di HNE sono stati raccolti presso l'ospedale Children's of Alabama. Tutte le procedure e i metodi qui descritti sono stati approvati dall'IRB University of Alabama di Birmingham (UAB IRB #151030001). Per facilitare l'espansione e migliorare la funzione delle cellule epiteliali nasali umane (HNE), gli attuali metodi di coltivazione sono adattati dal noto metodo di coltura dell'interfaccia aria-liquido (ALI)^28,34. Gli HNE sono stati inizialmente raccolti mediante biopsia a pennello come descritto in precedenza^12,14, con l'unica differenza che è l'uso di un pennello citologico. Tutte le fasi di lavorazione del campione e la coltura cellulare sono state eseguite nell'armadio di biosicurezza.

1. Coltura cellulare ed espansione delle cellule epiteliali nasali

1. Dopo la spazzolatura, conservare il campione di biopsia nasale in 8 mL di mezzi RPMI in un tubo conico da 15 mL su ghiaccio e trasferirlo in laboratorio entro 4 ore (non più di 24 ore).
2. Dissociare la biopsia del pennello nasale in 8 mL di mezzi RPMI in un tubo conico da 15 mL facendo passare il pennello citologico attraverso una punta della pipetta di 1 mL di grande diametro (tagliare la punta) più volte fino a quando il pennello è libero dal tessuto.
3. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e quindi sospendere nuovamente il pellet cellulare in 3 ml di soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 16 minuti per digerire.
4. Utilizzare 5 mL di mezzi di espansione (Tabella 1) per lavare le celle due volte. Quindi, aggiungere le cellule a un pallone T75 pre-seminato con fibroblasti 3T3²² irradiati e inattivati (confluenza del 50%-60%) per co-coltivare le cellule ed espandersi nel mezzo di espansione per 7-14 giorni (vedere figura 1 per la colonia appropriata). Prima dell'uso, testare i fibroblasti 3T3 irradiati per assicurarsi che non possano proliferare, il che influenzerà negativamente l'espansione delle cellule epiteliali.
   NOTA: Eliminare le cellule se la confluenza delle cellule epiteliali nasali non raggiunge il 70% entro 14 giorni.
5. Per le cellule derivate da pazienti con FC, introdurre quattro antibiotici (100 μg/mL di tobramicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B, 100 μg/mL di ceftazidima, 100 μg/mL di vancomicina, vedi Tabella dei materiali) nel mezzo di espansione per la disinfezione delle cellule per i primi 3 giorni di coltura, quindi sostituire il mezzo con mezzi di espansione privi di antibiotici cambiando il mezzo ogni 2 giorni.
   NOTA: Questo uso limitato di antibiotici ha lo scopo di ridurre la perdita di coltura dovuta alla colonizzazione batterica, incoraggiando al contempo la proliferazione dopo la rimozione degli antibiotici aggiuntivi. Questi antibiotici possono essere adattati ai risultati microbiologici specifici del paziente, con sensibilità, se necessario.
6. Raccogli gli HNE dalla co-coltura utilizzando il metodo di doppia tripsinizzazione²² una volta che le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza. Questo metodo garantisce che i fibroblasti 3T3 irradiati e inattivati vengano rimossi dal pallone e non contaminino la successiva semina organoide.
   1. Lavare le cellule con 1x DPBS, quindi aggiungere 1,5 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% nel pallone T75 per 4 minuti a 37 °C per rimuovere il fibroblasto 3T3 irradiato e inattivato dalla coltura.
   2. Risciacquare il pallone T75 con 1x DPBS due volte per lavare accuratamente via eventuali fibroblasti 3T3 rimanenti; aggiungere 1,5 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% nel matraccio T75 per 10 minuti a 37 °C per staccare gli HNE.
   3. Neutralizzare la tripsina con inibitore della tripsina di soia (vedere Tabella dei materiali) con un rapporto 1:1. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Dopo aver lavato le cellule con 5 ml di mezzi di espansione una volta, le cellule sono pronte per la semina per far crescere gli organoidi.
      NOTA: si consiglia di utilizzare HHNE con un numero di passaggio tre per ulteriori esperimenti.

2. Crescita e differenziazione degli organoidi in vetrini e inserti di coltura

1. Scongelare la matrice extracellulare di coltura organoide (ECM) durante la notte a 4 °C. Raffreddare le punte delle pipette a 4 °C e i vetrini per angiogenesi a 15 pozzetti (vedere Tabella dei materiali) durante la notte a 4 °C.
   NOTA: L'ECM deve essere messo a 4 °C la notte prima della raccolta delle cellule.
2. Rivestire i vetrini con 5 μL di ECM freddo al 100% su ghiaccio (pipetta 5 μL di ECM freddo al 100% con una punta di pipetta fredda in ciascun pozzetto della slitta a 15 pozzetti), quindi metterli in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per almeno 30 minuti per il consolidamento.
3. Contare gli HNE raccolti dalla co-coltura utilizzando un emocitometro e diluire le cellule a 500 cellule / μL in numero totale con il 20% di ECM diluito da mezzi di differenziazione (Tabella 2) sul ghiaccio. Quindi, seminare 5 μL della miscela a celle fredde/ ECM in ciascun pozzetto dei vetrini rivestiti con ECM.
4. Trasferire immediatamente i vetrini in un incubatore di coltura a 37 °C per 1 ora per consolidare la miscela cellula/ECM.
5. Nutrire le cellule in ciascun pozzetto dei vetrini di angiogenesi a 15 pozzetti con 50 μL di mezzi di differenziazione. Cambiare il supporto a giorni alterni fino a quando gli organoidi sono pronti per ulteriori esperimenti.
   NOTA: gli organoidi di solito possono essere visualizzati dopo 1-2 giorni. Ci sono 20-90 organoidi comunemente formati in ogni pozzetto delle diapositive. Gli organoidi possono tipicamente sopravvivere per 40-60 giorni in ECM con alimentazione a giorni alterni se tenuti in un incubatore umidificato a 37 °C.
6. Coltivare gli organoidi negli inserti di coltura (vedi Tabella dei materiali) per una maggiore quantità per applicazioni specifiche (come il sezionamento per istologia o immunofluorescenza) secondo i passaggi indicati di seguito.
   1. Per far crescere gli organoidi negli inserti di coltura, preparare la coltura organoide ECM, le punte delle pipette e gli inserti come indicato nei passaggi 2.1-2.2. Rivestire gli inserti con 100 μL di ECM freddo al 100%.
   2. Seme 60 μL di miscela cellulare/ECM (500 cellule/μL con il 20% di ECM in mezzi di differenziazione) sopra il rivestimento ECM nell'inserto.
      NOTA: Tutti gli altri passaggi per la realizzazione di organoidi negli inserti sono gli stessi di quelli condotti nelle diapositive, passaggi 2.4-2.5.
   3. Aggiungere 600 μL del mezzo di differenziazione nella parte inferiore dell'inserto. Cambiare i media a giorni alterni fino a quando gli organoidi non vengono utilizzati per gli esperimenti, in genere 2-3 settimane.

3. Preparazione e isolamento di organoidi per immunofluorescenza integrale

1. Isolamento e fissazione degli organoidi
   1. Pre-trattare vetrine con fondo di vetro a 8 pozzetti con adesivo cellulare (vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti seguendo il riferimento³⁵. Dopo aver scartato la soluzione, asciugare all'aria i pozzetti per 30 minuti.
   2. Per raccogliere gli organoidi, rimuovere il fluido dalla parte superiore dell'ECM, quindi aggiungere 50 μL di PBS 1x freddo in ciascun pozzetto dei vetrini a 15 pozzetti sul ghiaccio (1: 1 con volume ECM).
   3. Pipettare su e giù 3-5 volte utilizzando 200 μL della punta della pipetta di grande diametro, quindi erogare la soluzione al centro di un pozzo delle diapositive a camera a 8 pozzetti.
   4. Rimuovere immediatamente il liquido in eccesso dai pozzetti con una pipetta a punta fine. Quindi, posizionare lo scorrimento della camera in un incubatore a 37 °C per 40 minuti per migliorare l'organoide aderente al fondo di vetro.
   5. Dopo aver lavato delicatamente con 1x PBS due volte, fissare gli organoidi con 300 μL di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   6. Lavare due volte con 1x PBS e conservare gli organoidi in 1x PBS a 4 °C per immunocolorare fino a 2 settimane.
2. Colorazione immunofluorescenza
   1. Per ridurre l'autofluorescenza, aggiungere 250 μL di 50 mM NH₄Cl in 1x PBS in ciascun pozzetto delle diapositive a RT per 30 minuti mentre si agita delicatamente su uno shaker a 20 rpm.
   2. Dopo il lavaggio con 1x PBS due volte, permeabilizzare le celle con 0,1% Triton X-100 per 30 minuti a RT mentre si agita delicatamente a 20 rpm.
   3. Dopo il lavaggio con 1x PBS due volte, aggiungere 300 μL di soluzione bloccante, inclusi il 5% di BSA e lo 0,1% di Triton X-100 in 1x PBS, in ciascun pozzetto per 1 ora a RT.
   4. Dopo il lavaggio, aggiungere l'anticorpo primario nei pozzetti appropriati seguito da anticorpi secondari (vedere Tabella dei materiali). Preparare soluzioni anticorpali primarie e secondarie in 2% BSA e 0,3% Triton X-100 in 1x PBS. Incubare tutti gli anticorpi primari a 4 °C per 2 giorni e tutti gli anticorpi secondari a 4 °C per 1 giorno.
      NOTA: Le concentrazioni finali dipendono dalla proteina desiderata per l'esperimento. Si prega di controllare la concentrazione delle scorte sulla scheda tecnica del produttore. Quindi, calcolare le concentrazioni finali in base alle diluizioni utilizzate nella Tabella dei materiali.
   5. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente i pozzetti con 1x PBS e aggiungere DAPI in 2% BSA e 0,3% Triton X-100 in ciascun pozzetto per la colorazione nucleare.
   6. Immagina gli organoidi usando un microscopio a scansione laser confocale, con un obiettivo di immersione in olio 20-60x (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare la modalità Z-stack per impostare i limiti superiore e inferiore dell'immagine e utilizzare la dimensione ottimale del passaggio Z consigliata determinata dal software confocale.
      NOTA: sono state utilizzate le seguenti quattro lunghezze d'onda di eccitazione laser confocale: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm e 637,9 nm.

4. Preparazione e isolamento di organoidi per il sezionamento istologico

1. Per raccogliere gli organoidi per gli studi istologici, rimuovere il mezzo dalla coltura e aggiungere 50 μL di PBS freddo 1x in ciascun pozzetto dei vetrini sul ghiaccio.
2. Pipettare su e giù da tre a cinque volte utilizzando una punta di pipetta di grande diametro da 200 μL, combinare tutte le soluzioni dalla slitta a 15 pozzetti o inserti di coltura in un tubo conico da 15 ml su ghiaccio. Regolare il volume totale della soluzione nel tubo a 10 ml aggiungendo ulteriore PBS freddo 1x.
3. Centrifugare il tubo a 4 °C, 300 x g per 5 min; aspirare il surnatante e aggiungere 60 μL di istogel caldo (vedi Tabella dei materiali) per mescolare con il pellet organoide usando 200 μL della punta della pipetta di grande diametro.
4. Trasferire immediatamente la sospensione in uno stampo istologico. Dopo il consolidamento dell'histogel a temperatura ambiente, mettere il blocco dello stampo in paraformaldeide al 4% per la fissazione durante la notte a 4 °C.
5. Dopo l'incorporamento nella paraffina, tagliare il blocco di istogel in sezioni trasversali di 5 μm (ad esempio, con un microtomo), fissare le sezioni su vetrini e macchiare usando ematossilina ed eosina (H & E) o anticorpi marcati con immunofluorescenza. Scatta immagini usando un microscopio a campo luminoso o un microscopio a epifluorescenza invertita (vedi Tabella dei materiali).

5. Imaging di organoidi vivi

NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti utilizzando un sistema di imaging automatizzato (vedere Tabella dei materiali). Diversi sistemi di imaging devono adattare questi passaggi seguendo le istruzioni specifiche del produttore. Indipendentemente dalle apparecchiature utilizzate, l'imaging di organoidi vivi richiede una camera ambientale a temperatura controllata e umidificata con un regolatore di gas CO₂ accompagnato.

1. Per monitorare la differenziazione degli organoidi prima di eseguire un saggio di gonfiore funzionale³⁶, acquisire manualmente l'intera immagine del vetrino con qualsiasi microscopio a campo luminoso o con un sistema di imaging automatizzato, come descritto di seguito.
   1. Accendere il sistema di imaging automatizzato e il regolatore del gas CO₂/O₂ e consentire al sistema di completare la calibrazione automatica (~30 min).
   2. Dopo il completamento, impostare la temperatura del sistema di imaging su 37 °C; aggiungere 15 ml di acqua sterile al serbatoio di umidificazione, aprire le valvole CO₂ , chiudere i coperchi e lasciare che il sistema di imaging pre-incuba per un minimo di 30 minuti prima dell'imaging.
   3. Aprire il software di imaging automatizzato per impostare un protocollo per l'imaging e scegliere la posizione in cui salvare i dati sperimentali grezzi.
      NOTA: Un file di protocollo di esempio (file supplementare 1), specifico per il sistema di imaging, è stato fornito come modello per l'imaging automatizzato di organoidi per monitorare la differenziazione degli organoidi.
   4. Una volta soddisfatte le impostazioni ambientali, trasferire immediatamente fino a due vetrini a 15 pozzetti con coperchi nella camera ambientale nell'inserto porta diapositive del sistema di immagini automatizzato (vedere Tabella dei materiali).
   5. Selezionare i pozzetti da visualizzare e avviare l'imaging per completare l'imaging dei pozzetti desiderati.
      NOTA: le impostazioni di base consigliate sono: obiettivo aereo 4x e 10x, canale a campo luminoso, montaggio 2 x 2 per obiettivo 4x per coprire l'intera area del pozzo, montaggio 4 x 4 per un obiettivo 10x. Impostazioni Z-stack: da tre a sei sezioni Z-stack, dimensione Z-step = 50-100 μm, da una a due fette sotto il punto di messa a fuoco automatica e da tre a cinque sezioni sopra.
2. Per visualizzare organoidi vivi da utilizzare in un saggio di gonfiore indotto da forskolina (FIS), utilizzare un microscopio con uno stadio automatizzato dotato di una camera di imaging controllata dall'ambiente che consente il controllo della temperatura e della CO₂ .
   1. Iniziare con i passaggi 5.1.1-5.1.4, sostituire il file di protocollo nel passaggio 5.1.3 con quello fornito nel file di protocollo di esempio (file supplementare 2) contenente le impostazioni specifiche per l'esecuzione di un test FIS.
   2. Prima di ogni esperimento, regola le impostazioni di esposizione valutando almeno tre pozzetti per ogni diapositiva (all'estrema sinistra, al centro e all'estrema destra). Applicare gli offset delle coordinate X e Y per assicurarsi che l'obiettivo sia al centro del pozzo per tutti i pozzi.
      NOTA: le impostazioni di base consigliate sono: 4x air objective, Channel 1 = Bright Field, Channel 2 = DAPI, 2 x 2 montaggio (quattro riquadri immagine). Impostazioni Z-stack: da tre a quattro sezioni Z-stack, dimensione Z-step = 50-100 μm, una fetta sotto il punto di messa a fuoco automatica e due o tre fette sopra. Tempo di acquisizione dell'immagine: 8 h con intervalli di 20 minuti (letture totali = 25; La lettura 1 è T = 0).
   3. Una volta selezionate tutte le impostazioni in modo appropriato, scegliere i pozzetti da visualizzare per entrambe le diapositive o selezionare tutte e iniziare la corsa secondo le istruzioni dell'apparecchiatura.
   4. Dopo l'esecuzione, salvare l'esperimento, chiudere il software di imaging e arrestare il sistema^{di imaging 37}.

6. Misurazioni del lumen di base

NOTA: questa operazione viene eseguita utilizzando un software di analisi manuale delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Una metodologia simile può essere seguita utilizzando un software open source³⁸ o qualsiasi software in grado di misurare l'area di una regione su un'immagine.

1. Nel software, aprire il pannello di misurazione automatizzato facendo clic con il pulsante destro del mouse nella parte inferiore dello schermo, selezionare Misurazione e quindi Risultati misurazione automatizzati. L'area di ogni regione di interesse (ROI) misurata apparirà lì.
2. Apri l'immagine organoide nel software e seleziona 5-10 organoidi con lumen visibili.
   NOTA: Lumen sarà un'area circolare al centro dell'organoide che è visibilmente di colore diverso rispetto al resto dell'organoide (Figura 2A).
3. Utilizzando la funzione di misurazione del ROI poligonale, tenere premuto il pulsante destro del mouse sull'immagine per aprire il menu e selezionare ROI poligonale per delineare l'organoide completo per ottenere la superficie totale (TSA) dell'organoide. Quindi, utilizzando la stessa funzione, delineare l'area del lumen (LA) (Figura 2B).
4. Ripetere per gli organoidi rimanenti nel pozzo e tutti i pozzetti nel saggio.
5. Esportare i dati in Excel. Dividere il LA per la TSA e calcolare la media di tutti gli organoidi del campione per ottenere il Baseline Lumen Ratio (BLR)^11,13.
   NOTA: In genere, ~ 87% degli organoidi non CF avrà un BLR superiore a 0,6 e il 97% sarà superiore a 0,5, mentre solo il 14% degli organoidi CF avrà un BLR superiore a 0,6 e il 31% sarà superiore a 0,5.

7. Pre-trattamento e imaging automatizzato degli organoidi HNE

NOTA: Tutte le fasi di pretrattamento vengono eseguite in un armadio di biosicurezza pulito. Pre-configurare il sistema di imaging automatizzato e il software per la registrazione del test prima del passaggio 7.1. L'incubazione con DAPI è facoltativa ma è consigliata come fail-safe se la qualità delle immagini in campo luminoso è compromessa. In questo caso, il canale DAPI (377 nm) può essere analizzato.

1. Pre-incubare gli organoidi in un pozzo di vetrini a 15 pozzetti con 50 μL di mezzi di differenziazione contenenti DAPI con o senza 100 μM di CFTRinh-172 (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore a 37 °C per 1 ora. Mentre gli organoidi incubano, eseguire il passaggio 5.2.1 utilizzando un protocollo personalizzato per il saggio di rigonfiamento seguendo il file supplementare 2.
2. Rimuovere il mezzo di pre-incubazione utilizzando una pipetta Pasteur in vetro con aspirazione. Aggiungere 10 μM di forskolina e 100 μM di IBMX (cocktail di stimolazione) (vedere Tabella dei materiali) per un volume totale di 50 μL di mezzi di differenziazione in ciascun pozzetto.
   NOTA: Assicurarsi che non vengano introdotte bolle nei pozzetti. Le bolle sulle immagini influenzeranno l'analisi automatizzata.
3. Senza indugio, avviare il protocollo di imaging FIS seguendo i passaggi da 5.2.2 a 5.2.4. Acquisisci immagini ogni 20 minuti in ogni pozzo, con una durata totale di 8 ore.

8. Analisi automatizzata del saggio di gonfiore indotto da forskolina su organoidi HNE

1. Aprire il software di analisi automatica delle immagini, individuare l'esperimento precedentemente salvato dal passaggio 7.3 e visualizzare le immagini dell'esperimento.
2. Scegli la finestra della nave da valutare e seleziona l'opzione contenente le immagini elaborate che sono state cucite e proiettate a z. Questo passaggio dovrebbe fornire un'immagine dell'intero pozzo con tutti gli organoidi all'interno del quadro di imaging per la valutazione e le misurazioni del mascheramento.
3. Scegli l'immagine del pozzo da valutare. Seleziona Analizza. Ripetere questo processo per altre immagini per garantire un mascheramento appropriato per tutte le immagini incluse nelle misurazioni automatiche. Salvare i parametri di impostazione.
4. Dopo aver completato le impostazioni di analisi, applicare le modifiche. Il software modificherà le misurazioni in base alle impostazioni.
   NOTA: al termine della pre-elaborazione iniziale dell'immagine, è necessario eseguire misure di controllo qualità (QC) per garantire un mascheramento coerente. Questi includono la revisione manuale di tutti i pozzetti per garantire che gli organoidi siano all'interno del frame di imaging, bolle o detriti non siano mascherati in modo inappropriato e il controllo del mascheramento in campo luminoso e canali DAPI.
5. Esportare i dati per l'analisi riassuntiva (compresi grafici e analisi statistiche).

L'espansione delle HNE è essenziale per una fiorente coltura di organoidi. Gli HNE da una raccolta di campioni di successo dovrebbero espandersi a oltre il 70% di confluenza intorno ai 10 giorni. Un esempio di campioni riusciti e non riusciti è mostrato rispettivamente nella Figura 1A e nella Figura 1B. Le cellule devono essere scartate se non possono raggiungere il 70% di confluenza entro 14 giorni dalla co-coltura con cellule 3T3 irradiate. Tutte le cellule contaminate devono essere immediatamente scartate se non sono in grado di salvare rapidamente con agenti antimicrobici aggiuntivi.

La crescita degli organoidi è stata confrontata in vetrini a 15 pozzetti e inserti di coltura. Gli inserti di coltura sono più spessi e più lontani dall'obiettivo rispetto alle diapositive ottimizzate otticamente, influenzando l'immagine e la risoluzione. Nonostante ciò, non è stata osservata alcuna differenza significativa nella morfologia in questi due metodi di coltura, come mostrato nella Figura 2. Le differenze morfologiche possono essere osservate tra organoidi non CF e CF, come mostrato nella Figura 3A. Gli organoidi non CF tendono ad avere un lume più grande contenente più fluido al suo interno. Al contrario, gli organoidi CF di solito hanno un lume più piccolo con meno fluido e talvolta sono pieni di muco e detriti. La dimensione dei lumen è stata misurata manualmente (Figura 3B) e il rapporto di lumen basale è stato calcolato e mostrato nella Figura 3C. Gli organoidi a sezione trasversale sono stati caratterizzati utilizzando H&E e colorazione a immunofluorescenza. Le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 4A,B. I marcatori epiteliali delle vie aeree come ciglia, muco e giunzione stretta sono dimostrati negli organoidi mediante colorazione immunofluorescente a montaggio intero mostrata nella Figura 5A-D. A seconda dell'applicazione, è possibile utilizzare immunofluorescenza sezionata o a montaggio intero. Il metodo a montaggio intero mantiene la natura tridimensionale dell'organoide, mantenendo intatto l'interno dell'organoide, come mostrato nel lavoroprecedentemente pubblicato 13.

La funzione CFTR è stata valutata mediante test di gonfiore indotto da forskolina (FIS) utilizzando un sistema di imaging automatizzato. Solo le diapositive a 15 pozzetti vengono utilizzate per i test funzionali grazie alla migliore risoluzione dell'immagine. Un esperimento rappresentativo di forskolina dose-risposta di volontari non CF (n = 5 soggetti) è mostrato nella Figura 6A per illustrare il razionale del tempo di imaging e dell'analisi ottimizzati. I dati che confrontano le risposte organoidi non-CF e CF sono dettagliati nelle precedenti pubblicazioni11,13. Una dose-risposta mostra il cambiamento incrementale nell'attività del CFTR per dimostrare il miglior approccio alle misurazioni. Sono stati valutati la durata del test di 1 ora e 8 ore (Figura 6B, C) e l'analisi utilizzando la variazione frazionaria media (AFC) rispetto all'area sotto la curva (AUC) è vista nelle figure 6C, D. Sulla base della nostra esperienza precedente, il gonfiore per la maggior parte dei soggetti e le condizioni si stabilizzano dopo 8 ore e, in alcuni casi, provoca lo scoppio degli organoidi in quel periodo. Pertanto, i test erano limitati a sole 8 ore. A questa lunghezza di test estesa, il gonfiore diventa non lineare. L'uso dell'AUC considera anche sia le variazioni di dimensioni che il tasso di cambiamento. Pertanto, l'AUC superiore a 8 ore è stata utilizzata per tutti i saggi FIS nella metodologia finale.

Figura 1: Immagini in campo luminoso di HNE in co-cultura. Gli HNE si espandono in mezzi di espansione con fibroblasti 3T3 irradiati e inattivati per 10 giorni. Un microscopio a campo luminoso invertito viene utilizzato per l'imaging delle cellule. (A) Le HNE crescono bene in un grande cluster (freccia nera). Al contrario, in (B), gli HNE crescono male in due piccoli cluster (frecce nere) che circondano le cellule 3T3 irradiate. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Formazione di organoidi HNE in un inserto di diapositiva e coltura a 15 pozzetti. Le immagini a campo luminoso degli organoidi sono state catturate utilizzando un microscopio a campo luminoso invertito per 21 giorni. Gli organoidi nella diapositiva a 15 pozzetti (A) hanno immagini più precise e nitide di quelle nell'inserto di coltura (B). Non è stata osservata alcuna differenza morfologica tra gli organoidi coltivati nel vetrino e nell'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dimensione dei lumen organoidi (pannello A) e misurazioni dei lumen (pannello B e C). (A) Gli organoidi non CF hanno tipicamente un lume più grande e più fluido degli organoidi CF (F508del/F508del). (B) Un metodo per misurare manualmente la superficie totale (TSA) indicata dal contorno rosso e dall'area del lumen (LA) indicata dal contorno verde in un singolo organoide. (C) Un esempio per l'utilizzo della superficie totale e dell'area lumen per calcolare il rapporto lumen basale (LA: TSA) negli organoidi da un soggetto non CF rispetto a un soggetto CF. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sezione trasversale degli organoidi incorporati nella paraffina. (A) Un esempio di colorazione H&E in organoidi da un soggetto non-CF e CF (F508del/F508del). (B) Colorazione immunofluorescente delle ciglia in un organoide. Il verde è la ciglia (freccia bianca) macchiata di tubulina acetilata e anticorpo secondario marcato FITC, e il blu sono i nuclei etichettati con DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini confocali di immunofluorescenza a montaggio intero in organoidi. (A,C) Massimo proiezione di immagini dei due organoidi rappresentativi. (B,D) Immagini di ricostruzione tridimensionale di (A) e (C), rispettivamente. Un vetrino a 8 pozzetti è stato montato sulla piattaforma di un microscopio confocale e la lente 40x è stata utilizzata per creare le fotomicrografie. Il software di analisi dell'imaging è stato applicato per l'imaging e la ricostruzione delle immagini. Le frecce bianche indicano muco (in B) e ciglia (in C) all'interno del lume degli organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Motivazione della lunghezza del saggio di gonfiore e metodi di analisi. Test del gonfiore indotto da forskolina (FSK) (FIS) per testare la funzione CFTR sulle cellule epiteliali nasali primarie. Una dose diversa di forskolina indicata nelle figure è stata somministrata in organoidi di 21 giorni nei mezzi di differenziazione; il rigonfiamento organoide è stato immediatamente registrato con l'imager automatico per 8 ore. Dopo 8 ore, il gonfiore è mostrato in (A) (n = 5, soggetti non CF) utilizzando la variazione frazionaria media (AFC). La dose-risposta FSK viene confrontata con AFC a 1 ora (B) vs. a 8 ore (C), il che suggerisce che il test di 8 ore può produrre una differenza di gonfiore più significativa tra diverse dosi di FSK rispetto a quelle a 1 ora. AFC (C) rispetto all'area sotto la curva, AUC (D) a 8 h sono confrontati, indicando che l'AUC può riflettere una differenza di gonfiore minore rispetto all'AFC. L'asse X nei pannelli (B-D) rappresenta le diverse condizioni di trattamento corrispondenti ai simboli nella legenda della figura. Tutte le barre di errore nelle figure indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Tutti i componenti per la realizzazione dei supporti di espansione. Sono state descritte le informazioni dettagliate sulla concentrazione delle scorte di reagenti, lo stoccaggio delle scorte, la quantità di scorte per la produzione di un mezzo da 500 ml e la concentrazione finale. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Tutti i componenti per la realizzazione di mezzi di differenziazione. Sono state descritte le informazioni dettagliate sulla concentrazione delle scorte di reagenti, lo stoccaggio delle scorte, la quantità di scorte per la produzione di un mezzo da 500 ml e la concentrazione finale. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Un file di protocollo di esempio specifico per il sistema di imaging viene fornito come modello per l'imaging automatizzato degli organoidi per monitorare la differenziazione degli organoidi. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: un file di protocollo di esempio contenente le impostazioni specifiche per l'esecuzione di un test FIS. Fare clic qui per scaricare questo file.

JSG è elencato come inventore su una domanda di brevetto 20170242033 dell'Università della Carolina del Nord che descrive un modello simile. Quando la tecnologia concessa in licenza da UNC produce royalties, gli inventori ricevono una quota delle entrate. In caso contrario, gli autori non dichiarano conflitti di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta, nell'analisi o nell'interpretazione dei dati, nella scrittura del manoscritto o nella decisione di pubblicare i risultati.