Summary

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

Published: November 05, 2021
doi:

Summary

Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.

Abstract

Il follicolo dentale (DF) è stato raccolto durante la rimozione di un terzo molare colpito da un chirurgo maxillo-facciale orale. L’isolamento delle cellule epiteliali è stato eseguito il giorno della raccolta DF. Il DF è stato lavato tre volte con DPBS e poi sezionato con forbici di tessuto fino a quando il tessuto ha avuto una consistenza polposa o schiacciata. Le popolazioni unicellulari sono state pellettizzate mediante centrifugazione e lavate con un mezzo privo di siero di cheratinociti. Popolazioni cellulari eterogenee sono state distribuite in un piatto di coltura. Il mezzo privo di siero dei cheratinociti è stato utilizzato per selezionare le cellule epiteliali. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni giorno fino a quando non sono stati osservati detriti galleggianti o cellule morte. Le cellule epiteliali sono apparse entro 7-10 giorni dalla distribuzione della popolazione cellulare. Le cellule epiteliali sono sopravvissute in mezzo privo di siero, mentre il mezzo essenziale minimo di modificazione α integrato con il 10% di siero bovino fetale ha permesso la proliferazione di cellule di tipo mesenchimale. Il DF è una fonte di tessuto per l’isolamento delle cellule epiteliali dentali.

Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo per l’isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano. Il legamento parodontale (PDL) è stato utilizzato per l’isolamento delle cellule epiteliali dentali umane. L’approvvigionamento di cellule epiteliali dalla PDL umana non ha sempre successo a causa del piccolo volume tissutale, che porta a un basso numero di cellule epiteliali. DF ha un volume maggiore di PDL e contiene più celle. DF può essere una fonte di tessuto per la coltura primaria di cellule epiteliali dentali umane. Questo protocollo è più semplice ed efficiente rispetto al metodo di isolamento che utilizza PDL. L’approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane può facilitare ulteriori studi sulle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.

Introduction

La formazione dei denti inizia con l’invaginazione dell’epitelio orale1. Secondo lo stadio di sviluppo del dente, l’epitelio orale ha nomi diversi, tra cui l’epitelio dello smalto interno ed esterno, l’ansa cervicale e la guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERS). I compartimenti epiteliali comunicano con le cellule mesenchimali circostanti. Le interazioni epitelio-mesenchimali regolano la formazione dei denti e la rigenerazione dei tessuti. L’approvvigionamento di cellule epiteliali dentali, come i cheratinociti orali e le cellule della guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERSC), è fondamentale per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale2.

Le cellule epiteliali dentali derivate dai roditori sono isolate dalla struttura epiteliale, come l’HERS. Li e colleghi hanno isolato e immortalato le HERSC di derivazione molare del ratto dopo aver raccolto la porzione apicale dei germi dei denti in via di sviluppo da ratti di 8 giorni3. L’HERS è stato separato dal tessuto apicale sotto ingrandimento. Considerando lo stadio di sviluppo dei denti e l’età, la raccolta dell’HERS dagli esseri umani è quasi impossibile a causa di problemi etici: un germe dentale in via di sviluppo deve essere rimosso da un bambino piccolo per raccogliere l’HERS umano. I germi dei denti immaturi vengono estratti raramente. Le cellule epiteliali dentali umane possono essere isolate dalla gengiva e dal legamento parodontale (PDL). Le cellule derivate dalla struttura epiteliale partecipano alla formazione dei denti insieme ai componenti mesenchimali e potrebbero essere più adatte per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali rispetto ai cheratinociti orali. I resti di cellule epiteliali di Malassez (ERM) sono resti epiteliali derivati da HERS e risiedono in piccoli numeri nel PDL4. Gli studi riportano l’isolamento delle HERSC umane dalla PDL5. Tuttavia, la raccolta di HERSC umane dal tessuto PDL non ha sempre successo a causa della scarsità della popolazione epiteliale in questa posizione5,6.

Sebbene le HERSC derivate dai roditori siano mantenute in mezzi contenenti siero3,7, le cellule epiteliali umane derivate da DF sono coltivate con mezzi privi di siero simili ad altre cellule epiteliali umane, come i normali cheratinociti epidermici umani e i normali cheratinociti orali umani8,9. Ciò implica differenze fisiologiche o funzionali tra le cellule epiteliali dentali dei roditori e le cellule epiteliali dentali umane. Comprendere il meccanismo relativo alle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale potrebbe contribuire allo sviluppo di applicazioni cliniche, tra cui il riattaccamento parodontale durante il reimpianto, la rigenerazione parodontale nella malattia parodontale, la rigenerazione del complesso polpa-dentina e la generazione di biodenti. Considerando le caratteristiche della ricerca traslazionale, le cellule epiteliali dentali umane possono essere più appropriate delle cellule epiteliali dentali dei roditori per lo studio delle interazioni epitelio-mesenchimali.

Il DF umano è un tessuto connettivo sciolto e spesso risiede in un dente colpito. Il DF contiene precursori mesenchimali10. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha riportato l’isolamento delle cellule epiteliali dai follicoli dentali prima del 2021. Oh e Yi hanno riferito l’isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano nel 20218. Il fenotipo epiteliale è stato confermato dal western blotting e dall’analisi morfologica. L’analisi dell’origine delle cellule epiteliali derivate da DF ha dimostrato risultati simili con altri studi. Le cellule epiteliali derivate da DF non erano né endoteliali né ematopoietiche5,11, e Oh e Yi suggerivano di nominare queste cellule come DF-HERSC. Il DF ha un volume maggiore rispetto al PDL e più cellule epiteliali possono essere isolate dal DF. Ciò migliora l’emergere di colonie epiteliali e si traduce in un alto tasso di successo nella raccolta di cellule epiteliali da DF. Questo studio suggerisce di utilizzare il DF come fonte di tessuto per l’isolamento delle cellule epiteliali dentali.

Nel presente studio, singole cellule sono state isolate dal DF secondo le procedure precedentemente descritte10,12. Il DF contiene popolazioni cellulari eterogenee e diversi tipi di cellule potrebbero essere presenti nella fase iniziale della procedura. Morsczek e colleghi hanno isolato cellule staminali mesenchimali derivate da DF10. Abbiamo ipotizzato che il DF contenga cellule epiteliali e che solo le cellule epiteliali possano sopravvivere in condizioni prive di siero. Questo studio differisce da quello di Morsczek et al. in termini di selezione della popolazione epiteliale e di inibizione delle cellule mesenchimali. La selezione è stata eseguita utilizzando mezzi privi di siero di cheratinociti (SFM), che consentono la proliferazione delle cellule epiteliali e inibiscono la proliferazione delle cellule mesenchimali. Questo studio ha avuto origine da un rapporto di Oh e Yi8. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere i dettagli del metodo utilizzato in quel rapporto per l’isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano.

Protocol

Questo studio è stato approvato dall’Institutional Review Board del Kyung Hee University Hospital di Gangdong (approvazione IRB n. KHNMC 2017-06-009). 1. Raccogli DF NOTA: I pazienti hanno dato il consenso informato prima dell’intervento chirurgico per la rimozione di un terzo molare colpito maturo o immaturo. Sono stati esclusi i pazienti con la seguente malattia: diabete, ipertensione, tubercolosi, epatite, sindrome da immunodeficienza acquisita. A…

Representative Results

Raccolta DFLa chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. I materiali di derivazione umana, tra cui il frammento del dente, il tessuto gengivale e il DF, sono stati raccolti da un chirurgo (Figura 1A). Il DF potrebbe essere attaccato al frammento del dente. Un chirurgo maxillo-facciale orale sarà in grado di identificare il DF. La cooperazione e la comunicazione con il chirurgo sono necessarie per la raccolta dei tessuti. Il DF è un tessuto simil…

Discussion

Questo protocollo include passaggi critici. La raccolta di popolazioni monocellulari è essenziale per il successo dell’isolamento delle cellule epiteliali dalla DF. Abbiamo cercato di isolare le cellule epiteliali dal DF sulla base della nostra ipotesi che ci siano più cellule epiteliali nel DF. La procedura di tritatura migliora il distacco e il rilascio delle cellule dal DF. La procedura di tritatura è stata migliorata e la tritatura è stata ripetuta fino a quando il DF è apparso polposo per facilitare il rilascio…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Il Dr. Hee-Yeon Bae ha gentilmente fornito il DF per la cultura primaria.

Materials

EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol EMD millipore Co., MA, USA 1096341011 1 L
0.05% trypsin-EDTA Gibco, Grand island, NY, USA 25300054 100 mL
40 μm cell strainer Falcon, NC, USA 352340
Cell culture dish (100 x 20 mm) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 172958 Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 150326
Collagenase type 1 Gibco, Grand island, NY, USA 17100017 1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea CB-514R
Conical tube SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea 50015
50050
15 mL
50 mL
Cryogenic vial Corning Inc., NY, US 430488 2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Missouri, US D2650-100ml 100 mL
Dispase Gibco, Grand island, NY, USA 17105041 1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea  LB 001-02 500 mL
Fetal bovine serum Gibco, Grand island, NY, USA 16000044 500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 51023121
Keratinocyte serum-free medium Gibco, Grand island, NY, USA 10724-011 500 mL
MVE CryoSystem 2000 MVE Biological Solutions Co., GA, USA CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 5100-0001 for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope Olympus Life Science,
Waltham, Massachusetts
22-00723-01 Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep Gibco, Grand island, NY, USA 15140122 100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP Drummond scientific Co., PA, USA HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000 Gilson, Villiers le Bel, France F123602 100-1000 µL
Refrigerant Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan CLN 540U ~-80 °C / Discontinued
Serological pipet SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea 91010 10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 12605010 cell dissociation protease

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Jung, H., Yi, J. Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle. J. Vis. Exp. (177), e63104, doi:10.3791/63104 (2021).

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