Summary

Generazione di un modello di ischemia-riperfusione del gancio utilizzando un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni

Published: February 19, 2022
doi:

Summary

Questo documento descrive la modellazione ischemia-riperfusione (I / R) in un embrione di pulcino di 3 giorni utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale per comprendere meglio lo sviluppo e il trattamento I / R. Questo modello è semplice, veloce e poco costoso.

Abstract

I disturbi da ischemia e riperfusione (I / R), come infarto miocardico, ictus e malattia vascolare periferica, sono alcune delle principali cause di malattia e morte. Molti modelli in vitro e in vivo sono attualmente disponibili per lo studio del meccanismo I/R in malattie o tessuti danneggiati. Tuttavia, ad oggi, non è stato riportato alcun modello I/R in ovo, il che consentirebbe una migliore comprensione dei meccanismi I/R e uno screening farmacologico più rapido. Questo documento descrive la modellazione I / R utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale in un embrione di pulcino di 3 giorni per comprendere i meccanismi di sviluppo e trattamento I / R. Il nostro modello può essere utilizzato per studiare le anomalie a livello di DNA, RNA e proteine. Questo metodo è semplice, veloce e poco costoso. Il modello attuale può essere utilizzato indipendentemente o in combinazione con modelli I/R esistenti in vitro e in vivo.

Introduction

La lesione tissutale da ischemia-riperfusione è stata collegata a una serie di patologie, tra cui infarti, ictus ischemico, traumi e malattie vascolari periferiche1,2,3,4,5. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di una comprensione completa della progressione della malattia e alla mancanza di un modello di ricerca efficace. La lesione ischemica si verifica quando l’afflusso di sangue a un’area specifica del tessuto viene interrotto. Di conseguenza, il tessuto ischemico alla fine necrotizza, anche se il tasso varia a seconda del tessuto. Quindi, ripristinare l’afflusso di sangue può aiutare a mitigare il danno. Tuttavia, è stato osservato, in alcuni casi, che la riperfusione provoca più danni ai tessuti rispetto all’ischemia da sola6,7,8. Pertanto, è necessaria la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari dell’ischemia-riperfusione per sviluppare un intervento terapeutico efficace. Attualmente, non è noto alcun trattamento efficace per le lesioni I / R. Questa disparità ha spinto la creazione di nuovi modelli sperimentali, che vanno dai modelli in vitro a quelli in vivo, per affrontare il problema esistente9,10,11,12,13.

Gli embrioni di pulcino (Gallus gallus domesticus) sono ampiamente utilizzati nella ricerca a causa della loro facilità di accesso, accettabilità etica, dimensioni relativamente grandi (rispetto ad altri embrioni), basso costo e rapida crescita14. Abbiamo usato un embrione di pulcino a 72 ore di sviluppo per creare un in ovo I / R occludendo e rilasciando l’arteria vitellina destra con l’assistenza di un ago spinale. L’abbiamo chiamato hook-I/R ischemia-riperfusione modello (Figura 1). Il modello utilizzato in questo studio è in grado di simulare accuratamente tutti i processi a valle, comprese le vie ossidative e infiammatorie, che sono frequentemente associate al danno I/R15,16,17.

Protocol

L’Institutional Animal Ethical Committee presso il Lucknow Medical College and Hospital di Era ha emesso una rinuncia scritta affermando che non era richiesta alcuna approvazione formale per condurre questi esperimenti in conformità con il Comitato per lo scopo del controllo e della supervisione degli esperimenti sugli animali (CPCSEA). Tuttavia, sono state seguite procedure operative standard per ridurre al minimo qualsiasi potenziale di sofferenza embrionale. 1. Preparazione del tampo…

Representative Results

La tecnica Doppler Blood Flow Imaging è stata utilizzata per valutare l’efficacia del nostro modello. In breve, abbiamo confrontato i dati del gruppo di controllo con i dati del gruppo RVA per determinare il successo della nostra creazione. La Figura 4A raffigura un flusso tipico associato all’animale di controllo, mentre la Figura 4B illustra i risultati ottenuti da un RVA. Il numero 1-8 rappresenta i vari eventi associati alle fasi I/R. In breve, il numero 1-…

Discussion

L’obiettivo della ricerca ischemia-riperfusione è quello di creare strategie terapeutiche che prevengano la morte cellulare e promuovano il recupero29,30. Per superare gli attuali vincoli nella ricerca I/R, abbiamo progettato un modello di embrione di pulcino Hook I/R per produrre un modello I/R affidabile e riproducibile. Per quanto ne sappiamo, il nostro è il primo modello I / R mai creato in un embrione di pulcino di 3 giorni per esperimenti I / R di routine…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vogliamo esprimere la nostra gratitudine a Hari Shankar per i suoi input critici durante la videografia e il montaggio, Baqer Hussain per la voce fuori campo, Asghar Rizvi per il montaggio video, Mohammad Haider per le riprese video, Mohammad Danish Siddiqui per l’assistenza durante gli esperimenti.

Materials

(-80°C) freezer Haier, China
1.5mL Centrifuge tube TARSONS, India 500010X
100mm Petri dish (sterile) Tarsons, India 460050
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) Ramsons, India 13990
1mL Syringe DISPO VAN
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) DISPO VAN, india 30722D
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity Gentek, India GL-100
37°C laboratory incubator SCIENCE TECH, India CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA) Sigma Aldrich, USA M9281
3mL Pasture Pipette TARSONS, India 940050
50mL Beaker TARSONS, India
5mL Syringe DISPO VAN, India IP53
70% ethanol Merck Millipore, United States 64-17-5
Adhesive tape/Cello tape Sunrise, India
Ambra1 primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG Cell Signaling Technology, USA 7076S
Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno Research Laboratories, USA 711-035-152
Atg7 R&D Systems, USA MAB6608
Atg7 primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs00893766_m1
Autoclave Bag Tarsons, India 550022
Autoclave Machine Local made, Lucknow, India
Beclin-1 Proteintech, USA 66665-1-Ig
Beta Actin ImmunoTag, USA ITT07018
Bovine Serum Albumin Himedia, Mumbai, India TC194
Calcium Chloride Himedia, Mumbai, India GRM534
Catalase ImmunoTag, USA ITT5155
Cleaning wipes Kimberly-Clark, India 370080
Cleaved Caspase3 ImmunoTag, USA ITT07022
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate Himedia, Mumbai, India GRM39611
Doppler blood flowmeter Moors instrument, United Kingdom moorVMS-LDF1
Egg rack
Egg rack
GAPDH ImmunoTag, USA M1000110
GAPDH primers Applied Biosystems, Foster city, USA Hs02758991_g1
Glycine Himedia, Mumbai, India MB013
Kidney tray HOSPITO
LC3A/B Cell Signaling Technology, USA 4108S
Methanol Rankem laboratories, Mumbai, India M0252
Micromanipulator Narishige, Japan M-152
N-acetyl-L-cysteine (NAC) Sigma Aldrich, USA A7250
Naringenin Sigma Aldrich, USA 67604-48-2
NF-kβ Thermo Fisher Scientific, USA 51-0500
NLRP3 ImmunoTag, USA ITT07438
Nose plier Local made, Lucknow, India
Ocular forceps Stoelting, Germany 52106-40
Ocular iris Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP marker pen Camlin, India
ORP-150 ImmunoTag, USA ITT08329
Pointed sharp edge scissor Stoelting, Germany 52132-11
Potassium Chloride Himedia, Mumbai, India MB043
Potassium phosphate monobasic anhydrous Himedia, Mumbai, India MB050
Protease Inhibitor Abcam, United States Ab65621
SOD-1 ImmunoTag, USA ITT4364
Sodium Chloride Fisher Scientific, Mumbai, India 27605
Sodium dodecyl sulphate Himedia, Mumbai, India GRM886
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) Ramson, India GS-2029
Stereo Zoom surgical microscope Olympus, Japan SZ2-STU3
Syringe discarder BIOHAZARD 882210
Toothed forceps Stoelting, Germany 52102-30
Tris Base G Biosciences, United States RC1217
Tris Hydrochloric Acid Himedia, Mumbai, India MB030
Tween 20 G Biosciences, United States RC1227
White Leghorn Chicken 0-day eggs
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK MP Biomedicals, LLC, USA FK009

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Citazione di questo articolo
Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash, R., Siddiqui, A. J., Khan, M. A., Raza, S. S. Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo. J. Vis. Exp. (180), e63288, doi:10.3791/63288 (2022).

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