Questo documento descrive la modellazione ischemia-riperfusione (I / R) in un embrione di pulcino di 3 giorni utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale per comprendere meglio lo sviluppo e il trattamento I / R. Questo modello è semplice, veloce e poco costoso.
I disturbi da ischemia e riperfusione (I / R), come infarto miocardico, ictus e malattia vascolare periferica, sono alcune delle principali cause di malattia e morte. Molti modelli in vitro e in vivo sono attualmente disponibili per lo studio del meccanismo I/R in malattie o tessuti danneggiati. Tuttavia, ad oggi, non è stato riportato alcun modello I/R in ovo, il che consentirebbe una migliore comprensione dei meccanismi I/R e uno screening farmacologico più rapido. Questo documento descrive la modellazione I / R utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale in un embrione di pulcino di 3 giorni per comprendere i meccanismi di sviluppo e trattamento I / R. Il nostro modello può essere utilizzato per studiare le anomalie a livello di DNA, RNA e proteine. Questo metodo è semplice, veloce e poco costoso. Il modello attuale può essere utilizzato indipendentemente o in combinazione con modelli I/R esistenti in vitro e in vivo.
La lesione tissutale da ischemia-riperfusione è stata collegata a una serie di patologie, tra cui infarti, ictus ischemico, traumi e malattie vascolari periferiche1,2,3,4,5. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di una comprensione completa della progressione della malattia e alla mancanza di un modello di ricerca efficace. La lesione ischemica si verifica quando l’afflusso di sangue a un’area specifica del tessuto viene interrotto. Di conseguenza, il tessuto ischemico alla fine necrotizza, anche se il tasso varia a seconda del tessuto. Quindi, ripristinare l’afflusso di sangue può aiutare a mitigare il danno. Tuttavia, è stato osservato, in alcuni casi, che la riperfusione provoca più danni ai tessuti rispetto all’ischemia da sola6,7,8. Pertanto, è necessaria la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari dell’ischemia-riperfusione per sviluppare un intervento terapeutico efficace. Attualmente, non è noto alcun trattamento efficace per le lesioni I / R. Questa disparità ha spinto la creazione di nuovi modelli sperimentali, che vanno dai modelli in vitro a quelli in vivo, per affrontare il problema esistente9,10,11,12,13.
Gli embrioni di pulcino (Gallus gallus domesticus) sono ampiamente utilizzati nella ricerca a causa della loro facilità di accesso, accettabilità etica, dimensioni relativamente grandi (rispetto ad altri embrioni), basso costo e rapida crescita14. Abbiamo usato un embrione di pulcino a 72 ore di sviluppo per creare un in ovo I / R occludendo e rilasciando l’arteria vitellina destra con l’assistenza di un ago spinale. L’abbiamo chiamato hook-I/R ischemia-riperfusione modello (Figura 1). Il modello utilizzato in questo studio è in grado di simulare accuratamente tutti i processi a valle, comprese le vie ossidative e infiammatorie, che sono frequentemente associate al danno I/R15,16,17.
L’obiettivo della ricerca ischemia-riperfusione è quello di creare strategie terapeutiche che prevengano la morte cellulare e promuovano il recupero29,30. Per superare gli attuali vincoli nella ricerca I/R, abbiamo progettato un modello di embrione di pulcino Hook I/R per produrre un modello I/R affidabile e riproducibile. Per quanto ne sappiamo, il nostro è il primo modello I / R mai creato in un embrione di pulcino di 3 giorni per esperimenti I / R di routine…
The authors have nothing to disclose.
Vogliamo esprimere la nostra gratitudine a Hari Shankar per i suoi input critici durante la videografia e il montaggio, Baqer Hussain per la voce fuori campo, Asghar Rizvi per il montaggio video, Mohammad Haider per le riprese video, Mohammad Danish Siddiqui per l’assistenza durante gli esperimenti.
(-80°C) freezer | Haier, China | – | |
1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
Egg rack | – | – | |
Egg rack | – | – | |
GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
Kidney tray | HOSPITO | – | |
LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
OHP marker pen | Camlin, India | – | |
ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |