Summary

Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Published: April 28, 2022
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Summary

La membrana corioallantoica (CAM) dell’embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l’indagine del trattamento fotodinamico.

Abstract

La membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario è una sottile membrana extraembrionale che funziona come organo respiratorio primario. Le sue proprietà lo rendono un eccellente modello sperimentale in vivo per studiare l’angiogenesi, la crescita tumorale, i sistemi di somministrazione di farmaci o la diagnosi fotodinamica (PDD) e la terapia fotodinamica (PDT). Allo stesso tempo, questo modello affronta il requisito della sostituzione degli animali da esperimento con un’alternativa adeguata. L’embrione coltivato ex ovo consente una facile applicazione, accesso, monitoraggio e documentazione della sostanza. Il più frequentemente usato è pulcino CAM; tuttavia, questo articolo descrive i vantaggi del CAM di quaglia giapponese come modello a basso costo e ad alta produttività. Un altro vantaggio è lo sviluppo embrionale più breve, che consente un maggiore turnover sperimentale. L’idoneità della CAM di quaglia per PDD e PDT del cancro e delle infezioni microbiche è esplorata qui. Ad esempio, viene descritto l’uso del fotosensibilizzatore ipericina in combinazione con lipoproteine o nanoparticelle come sistema di consegna. È stato determinato il punteggio di danno dalle immagini in luce bianca e le variazioni dell’intensità di fluorescenza del tessuto CAM sotto luce violetta (405 nm), insieme all’analisi delle sezioni istologiche. La CAM di quaglia ha mostrato chiaramente l’effetto della PDT sulla vascolarizzazione e sul tessuto. Inoltre, si potrebbero osservare cambiamenti come emorragia capillare, trombosi, lisi di piccoli vasi e sanguinamento di vasi più grandi. La CAM di quaglia giapponese è un promettente modello in vivo per la diagnosi fotodinamica e la ricerca terapeutica, con applicazioni negli studi sull’angiogenesi tumorale e sulla terapia antivascolare e antimicrobica.

Introduction

Il modello della membrana corioallantoica (CAM) del pollo è ben noto e ampiamente utilizzato in varie aree di ricerca. È un organo extraembrionale riccamente vascolarizzato che fornisce lo scambio di gas e il trasporto di minerali1. Grazie alla trasparenza e all’accessibilità di questa membrana, i singoli vasi sanguigni e i loro cambiamenti strutturali possono essere osservati in tempo reale2. Nonostante i vantaggi, il pulcino CAM ha anche alcune limitazioni (ad esempio, strutture di allevamento più grandi, produzione di uova e consumo di mangime) che potrebbero essere evitate utilizzando altre specie aviarie. In questo protocollo, viene descritto un modello alternativo di CAM ex ovo utilizzando embrioni di quaglia giapponese (Coturnix japonica). A causa delle sue piccole dimensioni, consente l’uso di un numero molto maggiore di individui sperimentali rispetto al pollo CAM. Inoltre, lo sviluppo embrionale più breve di 16 giorni degli embrioni di quaglia è un altro vantaggio. I primi vasi più grandi su quaglia CAM compaiono il giorno embrionale (ED) 7. Questo può essere direttamente confrontato con lo sviluppo dell’embrione di pulcino (fasi 4-35); Tuttavia, le fasi successive dello sviluppo non sono più comparabili e richiedono meno tempo per l’embrione di quaglia3. Di interesse è la regolare comparsa di ramificazioni microvascolari simili a quelle delle CAM di pollo 4,5,6. La rapida maturazione sessuale, l’alta produzione di uova e l’allevamento a basso costo sono altri esempi che favoriscono l’uso di questo modello sperimentale7.

Un modello CAM aviario è spesso utilizzato negli studi di terapia fotodinamica (PDT)8. PDT è usato per trattare diverse forme di cancro (piccoli tumori localizzati) e altre malattie non oncologiche. Il suo principio è nella consegna di un farmaco fluorescente, un fotosensibilizzatore (PS), al tessuto danneggiato e la sua attivazione con la luce della lunghezza d’onda appropriata. Una PS prospettica utilizzata nella ricerca è l’ipericina, originariamente isolata dalla pianta medicinale erba di San Giovanni (Hypericum perforatum)9. I forti effetti fotosensibilizzanti di questo composto si basano sulle sue proprietà fotochimiche e fotofisiche. Questi sono caratterizzati da picchi di eccitazione di fluorescenza multipli nell’intervallo 400-600 nm, che inducono l’emissione di fluorescenza a circa 600 nm. I massimi di assorbimento dell’ipericina all’interno della banda spettrale sono nell’intervallo 540-590 nm e i massimi di fluorescenza sono nell’intervallo 590-640 nm9. Per ottenere questi effetti fotosensibilizzanti, l’ipericina viene eccitata dalla luce laser ad una lunghezza d’onda di 405 nm dopo somministrazione locale10. In presenza di luce, l’ipericina può mostrare effetti virucidi, antiproliferativi e citotossici11, mentre non vi è tossicità sistemica e viene rapidamente rilasciata dall’organismo. L’ipericina è una sostanza lipofila che forma aggregati non fluorescenti insolubili in acqua, motivo per cui diversi tipi di nanocarrier, come le nanoparticelle polimeriche 12,13 o le lipoproteine ad alta e bassa densità (HDL, LDL)14,15, vengono utilizzati per aiutare la sua consegna e penetrazione nelle cellule. Poiché la CAM è un sistema naturalmente immunodeficiente, le cellule tumorali possono essere impiantate direttamente sulla superficie della membrana. Il modello è anche adatto per registrare l’entità del danno vascolare indotto da PDT secondo un punteggio definito16,17. La luce di intensità inferiore rispetto alla PDT può essere utilizzata per la diagnosi fotodinamica (PDD). Il monitoraggio del tessuto sotto eccitazione viola La luce LED porta anche alla fotoattivazione dei fotosensibilizzatori18,19,20 che si traduce in un’emissione di luce fluorescente, ma non fornisce energia sufficiente per avviare una reazione PDT e danneggiare le cellule. Lo rende un buon strumento per la visualizzazione e la diagnosi del tumore o il monitoraggio della farmacocinetica dei PSs14,15 usati.

Questo articolo descrive la preparazione del test CAM di quaglia ex ovo con tassi di sopravvivenza superiori all’80%. Questa coltura ex ovo è stata applicata con successo in un gran numero di esperimenti.

Protocol

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. Tutte le apparecchiature e i reagenti devono essere sterilizzati in autoclave o sterilizzati con etanolo al 70% o luce UV. 1. Incubazione delle uova Conservare le uova di quaglia fecondate a 10-15 °C per un massimo di 4-5 giorni prima di iniziare l’incubazione. Utilizzare solo uova pulite e non danneggiate. Incubare le uova in un’incubatrice a tiraggio forzato per ~ 53-54 h. Deporre…

Representative Results

La localizzazione del tumore sulla superficie CAM è difficile in luce bianca. Il fotosensibilizzatore (qui, l’ipericina) utilizzato nella PDD dovrebbe essere assorbito selettivamente dal tumore e aiuta a visualizzare il tumore. L’aggiunta di ipericina e l’uso di luce fluorescente (ad esempio, 405 nm) hanno mostrato molto bene la posizione del tumore (carcinoma a cellule squamose TE1) (Figura 6A). L’analisi istologica ha mostrato cellule tumorali vitali che invadono i tessuti sani. Strutture…

Discussion

Per una coltivazione ex ovo di successo, è importante seguire il protocollo di cui sopra. Inoltre, se le uova non vengono aperte con sufficiente attenzione o c’è umidità insufficiente durante la coltivazione, il sacco del tuorlo si attacca al guscio e spesso si rompe. L’inizio di una coltivazione ex ovo al momento di circa 60 ore di incubazione dell’uovo garantisce l’alto tasso di sopravvivenza degli embrioni, poiché sono già abbastanza grandi da sopravvivere alla manipolazione. Nelle fasi successi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto da VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. Il contributo di V. Huntošová è il risultato dell’implementazione del progetto: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Acronimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 supportato dal Programma Operativo Integrato Infrastruttura, finanziato dal FESR.

Materials

6-Well Cell Culture Plate Sarstedt 83.392 Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 ESCO, Singapore CCL-050B-8 CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800 Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II Canon, Japan
diode laser 405 nm Ocean Optics, USA
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5 dimethyl sulfoxid
eosin Sigma-Aldrich 15086-94-9
ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
fine brush size 2 Faber-Castell 281802 brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde Sigma-Aldrich 111-30-8
hematoxylin Sigma-Aldrich 517-28-2
hypericin Sigma-Aldrich 84082-80-4
incubator Bios Midi Bios SedlEquation 1any, Czech Republic Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160 Memmert, Germany Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box Kaiser, Germany 2453 Transilluminator
LED light 405 nm custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 Canon, Japan
microscope Kapa 2000 Kvant, Slovakia optical microscope
microtome Auxilab 508 Auxilab, Spain manual rotary microtome
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 parafin medium for tissue embedding
PBS Sigma-Aldrich P4417 Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo Orimed  OR66-108 micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53 public domain image processing and analysis program
stock solution HDL Sigma-Aldrich 437641-10MG high density lipoproteins
stock solution LDL Sigma-Aldrich 437644-10MG low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583 Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles

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Citazione di questo articolo
Máčajová, M., Huntošová, V., Meta, M., Kundeková, B., Čavarga, I., Bilčík, B. Quail Chorioallantoic Membrane – A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63422, doi:10.3791/63422 (2022).

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