La membrana corioallantoica (CAM) dell’embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l’indagine del trattamento fotodinamico.
La membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario è una sottile membrana extraembrionale che funziona come organo respiratorio primario. Le sue proprietà lo rendono un eccellente modello sperimentale in vivo per studiare l’angiogenesi, la crescita tumorale, i sistemi di somministrazione di farmaci o la diagnosi fotodinamica (PDD) e la terapia fotodinamica (PDT). Allo stesso tempo, questo modello affronta il requisito della sostituzione degli animali da esperimento con un’alternativa adeguata. L’embrione coltivato ex ovo consente una facile applicazione, accesso, monitoraggio e documentazione della sostanza. Il più frequentemente usato è pulcino CAM; tuttavia, questo articolo descrive i vantaggi del CAM di quaglia giapponese come modello a basso costo e ad alta produttività. Un altro vantaggio è lo sviluppo embrionale più breve, che consente un maggiore turnover sperimentale. L’idoneità della CAM di quaglia per PDD e PDT del cancro e delle infezioni microbiche è esplorata qui. Ad esempio, viene descritto l’uso del fotosensibilizzatore ipericina in combinazione con lipoproteine o nanoparticelle come sistema di consegna. È stato determinato il punteggio di danno dalle immagini in luce bianca e le variazioni dell’intensità di fluorescenza del tessuto CAM sotto luce violetta (405 nm), insieme all’analisi delle sezioni istologiche. La CAM di quaglia ha mostrato chiaramente l’effetto della PDT sulla vascolarizzazione e sul tessuto. Inoltre, si potrebbero osservare cambiamenti come emorragia capillare, trombosi, lisi di piccoli vasi e sanguinamento di vasi più grandi. La CAM di quaglia giapponese è un promettente modello in vivo per la diagnosi fotodinamica e la ricerca terapeutica, con applicazioni negli studi sull’angiogenesi tumorale e sulla terapia antivascolare e antimicrobica.
Il modello della membrana corioallantoica (CAM) del pollo è ben noto e ampiamente utilizzato in varie aree di ricerca. È un organo extraembrionale riccamente vascolarizzato che fornisce lo scambio di gas e il trasporto di minerali1. Grazie alla trasparenza e all’accessibilità di questa membrana, i singoli vasi sanguigni e i loro cambiamenti strutturali possono essere osservati in tempo reale2. Nonostante i vantaggi, il pulcino CAM ha anche alcune limitazioni (ad esempio, strutture di allevamento più grandi, produzione di uova e consumo di mangime) che potrebbero essere evitate utilizzando altre specie aviarie. In questo protocollo, viene descritto un modello alternativo di CAM ex ovo utilizzando embrioni di quaglia giapponese (Coturnix japonica). A causa delle sue piccole dimensioni, consente l’uso di un numero molto maggiore di individui sperimentali rispetto al pollo CAM. Inoltre, lo sviluppo embrionale più breve di 16 giorni degli embrioni di quaglia è un altro vantaggio. I primi vasi più grandi su quaglia CAM compaiono il giorno embrionale (ED) 7. Questo può essere direttamente confrontato con lo sviluppo dell’embrione di pulcino (fasi 4-35); Tuttavia, le fasi successive dello sviluppo non sono più comparabili e richiedono meno tempo per l’embrione di quaglia3. Di interesse è la regolare comparsa di ramificazioni microvascolari simili a quelle delle CAM di pollo 4,5,6. La rapida maturazione sessuale, l’alta produzione di uova e l’allevamento a basso costo sono altri esempi che favoriscono l’uso di questo modello sperimentale7.
Un modello CAM aviario è spesso utilizzato negli studi di terapia fotodinamica (PDT)8. PDT è usato per trattare diverse forme di cancro (piccoli tumori localizzati) e altre malattie non oncologiche. Il suo principio è nella consegna di un farmaco fluorescente, un fotosensibilizzatore (PS), al tessuto danneggiato e la sua attivazione con la luce della lunghezza d’onda appropriata. Una PS prospettica utilizzata nella ricerca è l’ipericina, originariamente isolata dalla pianta medicinale erba di San Giovanni (Hypericum perforatum)9. I forti effetti fotosensibilizzanti di questo composto si basano sulle sue proprietà fotochimiche e fotofisiche. Questi sono caratterizzati da picchi di eccitazione di fluorescenza multipli nell’intervallo 400-600 nm, che inducono l’emissione di fluorescenza a circa 600 nm. I massimi di assorbimento dell’ipericina all’interno della banda spettrale sono nell’intervallo 540-590 nm e i massimi di fluorescenza sono nell’intervallo 590-640 nm9. Per ottenere questi effetti fotosensibilizzanti, l’ipericina viene eccitata dalla luce laser ad una lunghezza d’onda di 405 nm dopo somministrazione locale10. In presenza di luce, l’ipericina può mostrare effetti virucidi, antiproliferativi e citotossici11, mentre non vi è tossicità sistemica e viene rapidamente rilasciata dall’organismo. L’ipericina è una sostanza lipofila che forma aggregati non fluorescenti insolubili in acqua, motivo per cui diversi tipi di nanocarrier, come le nanoparticelle polimeriche 12,13 o le lipoproteine ad alta e bassa densità (HDL, LDL)14,15, vengono utilizzati per aiutare la sua consegna e penetrazione nelle cellule. Poiché la CAM è un sistema naturalmente immunodeficiente, le cellule tumorali possono essere impiantate direttamente sulla superficie della membrana. Il modello è anche adatto per registrare l’entità del danno vascolare indotto da PDT secondo un punteggio definito16,17. La luce di intensità inferiore rispetto alla PDT può essere utilizzata per la diagnosi fotodinamica (PDD). Il monitoraggio del tessuto sotto eccitazione viola La luce LED porta anche alla fotoattivazione dei fotosensibilizzatori18,19,20 che si traduce in un’emissione di luce fluorescente, ma non fornisce energia sufficiente per avviare una reazione PDT e danneggiare le cellule. Lo rende un buon strumento per la visualizzazione e la diagnosi del tumore o il monitoraggio della farmacocinetica dei PSs14,15 usati.
Questo articolo descrive la preparazione del test CAM di quaglia ex ovo con tassi di sopravvivenza superiori all’80%. Questa coltura ex ovo è stata applicata con successo in un gran numero di esperimenti.
Per una coltivazione ex ovo di successo, è importante seguire il protocollo di cui sopra. Inoltre, se le uova non vengono aperte con sufficiente attenzione o c’è umidità insufficiente durante la coltivazione, il sacco del tuorlo si attacca al guscio e spesso si rompe. L’inizio di una coltivazione ex ovo al momento di circa 60 ore di incubazione dell’uovo garantisce l’alto tasso di sopravvivenza degli embrioni, poiché sono già abbastanza grandi da sopravvivere alla manipolazione. Nelle fasi successi…
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro è stato sostenuto da VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. Il contributo di V. Huntošová è il risultato dell’implementazione del progetto: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Acronimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 supportato dal Programma Operativo Integrato Infrastruttura, finanziato dal FESR.
6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
incubator Bios Midi | Bios Sedlany, Czech Republic | Forced draught incubator for initial incubation | |
incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |