Summary

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l’interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Abstract

Nel corpo umano, la maggior parte delle principali reazioni fisiologiche coinvolte nella risposta immunitaria e nella coagulazione del sangue procedono sulle membrane delle cellule. Un primo passo importante in qualsiasi reazione dipendente dalla membrana è il legame delle proteine sulla membrana fosfolipidica. Un approccio allo studio dell’interazione proteica con le membrane lipidiche è stato sviluppato utilizzando proteine marcate fluorescentemente e citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio delle interazioni proteina-membrana utilizzando cellule vive e vescicole fosfolipidiche naturali o artificiali. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. In questo metodo, le proteine sono etichettate utilizzando coloranti fluorescenti. Tuttavia, possono essere utilizzate sia proteine autoprodotte che disponibili in commercio, etichettate in modo fluorescente. Dopo la coniugazione con un colorante fluorescente, le proteine vengono incubate con una fonte della membrana fosfolipidica (microvescicole o cellule) e i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso. I dati ottenuti possono essere utilizzati per calcolare le costanti cinetiche e l’equilibrio Kd. Inoltre, è possibile stimare il numero approssimativo di siti di legame proteico sulla membrana fosfolipidica utilizzando speciali perle di calibrazione.

Introduction

Le biomembrane separano il contenuto interno delle cellule animali e lo spazio extracellulare. Si noti che le membrane circondano anche le microvescicole formate durante il ciclo di vita della cellula e gli organelli. La membrana cellulare è prevalentemente composta da lipidi e proteine. Le proteine di membrana svolgono funzioni di segnalazione, strutturali, di trasporto e adesive. Tuttavia, il doppio strato lipidico è anche essenziale per l’interrelazione della cellula animale con lo spazio extracellulare. Questo documento propone un metodo per studiare l’interazione periferica delle proteine esterne con la membrana lipidica.

L’esempio più eclatante di reazioni che si verificano sullo strato esterno della membrana di una cellula animale è la reazione di coagulazione del sangue. Una caratteristica importante della coagulazione del sangue è che tutte le principali reazioni procedono sulle membrane fosfolipidiche delle cellule e delle microvescicole derivanti da queste cellule e non nel plasma 1,2,3. Le reazioni dipendenti dalla membrana includono il processo di coagulazione iniziale (sulle membrane cellulari del subendotelio, dell’endotelio infiammato o delle cellule immunitarie attivate, con la partecipazione di un fattore tissutale), tutte le reazioni della principale attivazione a cascata dei fattori IX, X, protrombina; attivazione del fattore XI da parte della trombina (sulle membrane di piastrine attivate, eritrociti, lipoproteine e microvescicole); reazioni della via della proteina C; inattivazione degli enzimi della coagulazione (sulle membrane delle cellule endoteliali con la partecipazione di cofattori di trombomodulina, recettore C della proteina endoteliale, eparan solfato); e reazioni alle vie di contatto (su membrane di piastrine e alcune microvescicole con la partecipazione di cofattori sconosciuti). Pertanto, è impossibile indagare sulla coagulazione del sangue senza studiare l’interazione di varie proteine plasmatiche con la membrana delle cellule del sangue.

Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per caratterizzare l’interazione delle proteine con le membrane lipidiche delle cellule o delle microvescicole. Questo approccio è stato inizialmente proposto per studiare l’interazione del plasma sanguigno con piastrine e vescicole fosfolipidiche artificiali. Inoltre, la maggior parte delle proteine studiate interagisce direttamente con i fosfolipidi di membrana caricati negativamente, in particolare con la fosfatidilserina 4,5. Inoltre, ci sono proteine la cui interazione con la membrana è mediata da speciali recettori6.

Un’importante capacità della citometria a flusso è la discriminazione tra ligandi liberi e legati senza separazione aggiuntiva. Questa caratteristica della citometria consente lo studio del legame di equilibrio del ligando all’endpoint e aiuta a eseguire misurazioni cinetiche continue. La tecnica non è sofisticata e non richiede una preparazione complessa del campione. La citometria a flusso viene utilizzata attivamente per studiare quantitativamente la dinamica di interazione tra peptidi fluorescenti, recettori e proteine G in neutrofili intatti e permeabili ai detergenti7. Questo approccio è applicabile anche per esplorare le interazioni proteina-DNA e la cinetica dell’attività dell’endonucleasi in tempo reale8. Nel corso del tempo, questo metodo è stato utilizzato per studiare quantitativamente le interazioni proteina-proteina ad alta affinità con le vescicole lipidiche purificate9 o, più in generale, con le proteine di membrana espresse in un sistema di espressione cellulare Sf9 altamente efficiente10. Sono stati descritti anche metodi quantitativi per caratterizzare le interazioni proteina-liposoma utilizzando la citometria a flusso per le proteine transmembrana11.

Questa tecnica utilizza perline di calibrazione autoprodotte per evitare l’uso di perline7 disponibili in commercio. Le perle di calibrazione utilizzate in precedenza7 erano destinate a funzionare con la fluoresceina, che limitava sostanzialmente l’assortimento di ligandi fluorescenti accessibili sulle proteine. Inoltre, questo documento offre un nuovo modo per acquisire e analizzare i dati cinetici per una risoluzione temporale ragionevole. Sebbene questo metodo sia descritto per le vescicole fosfolipidiche artificiali, non ci sono limitazioni evidenti per la sua adattabilità a cellule, vescicole naturali o vescicole fosfolipidiche artificiali con una diversa composizione lipidica. Il metodo qui descritto consente la stima dei parametri di interazione (kon, koff) ed equilibrio (Kd) e facilita la caratterizzazione quantitativa del numero di siti di legame proteico sulla membrana. Si noti che questa tecnica fornisce una stima approssimativa del numero di siti di associazione. I vantaggi del metodo sono la sua relativa semplicità, accessibilità e adattabilità alle cellule native e alle microvescicole naturali e artificiali.

Protocol

1. Etichettatura delle proteine fluorescenti Preparazione del materiale Preparare il tampone di bicarbonato di sodio 1 M, pH 9,0, conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro una settimana. Preparare il tampone idrossilammina cloridrato da 1,5 M, pH 8,5, immediatamente prima dell’uso. Preparare una soluzione da 10 mg/mL di colorante fluorescente (vedere la Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido.NOTA: questa soluzione può essere conservata per …

Representative Results

Il metodo di citometria a flusso qui descritto viene utilizzato per caratterizzare il legame delle proteine della coagulazione plasmatica alle piastrine attivate. Inoltre, le vescicole di fosfolipidi PS:PC 20:80 sono state applicate come sistema modello. Questo documento si concentra principalmente sulle vescicole fosfolipidiche artificiali come esempio. I parametri del citometro, in particolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e la compensazione devono essere selezionati per ogni dispositivo specifico, l’og…

Discussion

Il metodo proposto può essere adattato per una caratterizzazione approssimativa dell’interazione delle proteine con membrane fosfolipidiche provenienti da varie fonti e composizioni. La citometria quantitativa a flusso qui descritta concede alla risonanza plasmonica di superficie (SPR) in diversi parametri. In particolare, ha una sensibilità e una risoluzione temporale inferiori e richiede l’etichettatura fluorescente delle proteine. L’etichettatura fluorescente può portare a un cambiamento nella conformazione e alla …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono stati supportati da una sovvenzione della Russian Science Foundation 20-74-00133.

Materials

A23187 Sigma Aldrich C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A37573 fluorescent dye
Apyrase from potatoes Sigma Aldrich A2230
BD FACSCantoII BD Bioscience
bovine serum albumin VWR Life Science AMRESCO Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% Sigma Aldrich C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer Agilent
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) Thermo Fisher Scientific D384
DMSO Sigma Aldrich D8418
EDTA disodium salt VWR Life Science AMRESCO Am-O105B-0.1
FACSDiva BD Bioscience cytometry data acquisition software
FlowJo Tree Star cytometer software for data analysis
HEPES Sigma Aldrich H4034-500G
Human Factor X Enzyme research HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride Panreac 141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids 840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840032P
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266-100G
Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951 OriginLab Corporation Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade VWR Life Science AMRESCO 97062-732
Potassium chloride Sigma Aldrich P9541-500G
Prostaglandin E1 Cayman Chemical 13010
Sephadex G25 GE Healthcare GE17-0033-01 gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B Sigma Aldrich CL2B300-500ML gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate Corning 61-065-RO
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm Sartorius VS0171
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804-1KG

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Podoplelova, N., Soloveva, P., Garzon Dasgupta, A., Filkova, A., Panteleev, M. Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (182), e63459, doi:10.3791/63459 (2022).

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