Qui, presentiamo un protocollo per fratturare iatrogenicamente l’asta del femore dei ratti albini Wistar e seguire lo sviluppo del callo. Questo modello di osteotomia del femore può aiutare i ricercatori a valutare il processo di guarigione delle fratture e a studiare come un farmaco potrebbe influenzare la guarigione delle fratture.
La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l’azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti. I farmaci osteoanabolizzanti hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi elevati o effetti collaterali indesiderati. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di roditore osteotomia del femore che potesse aiutare i ricercatori a comprendere lo sviluppo della formazione di callo dopo la frattura dell’albero del femore e che potesse aiutare a stabilire se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea. I ratti albini Wistar maschi adulti sono stati utilizzati dopo l’autorizzazione del Comitato etico istituzionale per gli animali. I roditori sono stati anestetizzati e, in condizioni asettiche, sono state create fratture trasversali complete al terzo centrale degli alberi dei femori utilizzando l’osteotomia aperta. Le fratture sono state ridotte e fissate internamente utilizzando fili K intramidollari e la guarigione secondaria delle fratture è stata consentita. Dopo l’intervento chirurgico, analgesici intraperitoneali e antibiotici sono stati somministrati per 5 giorni. Le radiografie settimanali sequenziali hanno valutato la formazione di callo. I ratti sono stati sacrificati sulla base di punti temporali radiologicamente predeterminati e lo sviluppo del callo della frattura è stato analizzato radiologicamente e utilizzando l’immunoistochimica.
L’osso è un tessuto connettivo denso costituito da cellule che formano l’osso, gli osteoblasti e le cellule che riassorbono l’osso, gli osteoclasti. La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l’azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti1. Quando c’è una frattura, l’attività osteoblastica e osteoclastica nel sito della frattura sono alcuni dei fattori importanti che determinano la guarigione ossea2. Quando la guarigione delle fratture devia dal suo corso normale, si traduce in un’unione ritardata, in una malunione o in una non unione. Una frattura si dice non unione quando c’è un fallimento dell’unione della frattura per 9 mesi, senza progressione di riparazione negli ultimi 3 mesi3. Circa il 10%-15% di tutte le fratture subisce un ritardo nella riparazione che può progredire fino alla non-unione4. Il tasso di non unione per tutte le fratture è del 5% -10% e varia a seconda dell’osso coinvolto e del sito di frattura5.
L’attuale regime per il trattamento della non unione delle fratture comprende modalità chirurgiche e/o mediche. Attualmente, il ritardo o la mancata unione delle fratture può essere superato da strategie chirurgiche come l’innesto osseo. Tuttavia, l’innesto osseo ha i suoi limiti e complicazioni come la disponibilità di tessuto di innesto, il dolore del sito donatore, la morbilità e l’infezione6. Il trattamento medico comprende farmaci osteoanabolizzanti come la proteina morfogenetica ossea (BMP) e teriparatide (analogo paratormonale). Gli agenti osteoanabolizzanti attualmente utilizzati hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi esorbitanti o effetti collaterali indesiderati7. Quindi, c’è spazio per identificare alternative economiche e non chirurgiche per la guarigione ossea. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Un farmaco noto per migliorare la guarigione ossea deve essere valutato in vitro e, se trovato promettente, può essere utilizzato per studi su modelli animali in vivo . Se il farmaco dimostra di promuovere la formazione e il rimodellamento osseo nel modello in vivo , potrebbe procedere alla fase successiva (cioè studi clinici).
Valutare la guarigione delle fratture negli animali è un passo avanti logico per valutare un nuovo agente introdotto per la guarigione ossea prima che venga sottoposto a prove umane. Per gli studi in vivo su modelli animali di guarigione delle fratture, i roditori sono diventatiun modello 8 sempre più popolare. I modelli di roditori hanno generato un crescente interesse a causa dei bassi costi operativi, della limitata necessità di spazio e del minor tempo necessario per la guarigione delle ossa9. Inoltre, i roditori hanno un ampio spettro di anticorpi e bersagli genici, che consentono studi sui meccanismi molecolari di guarigione e rigenerazione ossea10. Una riunione di consenso ha evidenziato in modo completo vari modelli di guarigione delle ossa di piccoli animali e si è concentrata sui diversi parametri che influenzano la guarigione ossea, oltre a sottolineare diversi modelli di fratture e impianti di piccoli animali11.
I modelli di frattura di base possono essere ampiamente suddivisi in modelli aperti o chiusi. I modelli di frattura chiusa utilizzano una forza di flessione a tre o quattro punti sull’osso e non richiedono un approccio chirurgico convenzionale. Portano a fratture oblique o a spirale, simili a fratture ossee lunghe negli esseri umani, ma la mancanza di standardizzazione della posizione e delle dimensioni della frattura può agire come fattore di confusione in loro12. I modelli di frattura aperti richiedono l’accesso chirurgico per l’osteotomia dell’osso, aiutano a raggiungere un modello di frattura più coerente nel sito di frattura, ma sono associati a una guarigione ritardata rispetto ai modelli chiusi13. La scelta dell’osso utilizzato per studiare la guarigione delle fratture rimane principalmente la tibia e il femore a causa delle loro dimensioni e accessibilità. La scelta del sito di frattura è di solito la diafisi o metafisi. La regione metafisaria è appositamente scelta nei casi in cui la guarigione delle fratture è studiata in soggetti osteoporotici, poiché la metafisi è più influenzata dall’osteoporosi14. Diversi impianti come perni intramidollari e fissatori esterni possono essere utilizzati per stabilizzare la frattura11,15.
L’obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un modello di roditore semplice e facile da seguire che potesse aiutare i ricercatori non solo a comprendere lo sviluppo del callo dopo la frattura del femore, ma potrebbe aiutare a determinare se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea comprendendo il meccanismo con cui agisce.
Questo metodo descrive lucidamente i dettagli necessari per sviluppare un modello di osteotomia per frattura nei ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare l’effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione delle fratture, nonché per comprendere la complessità della guarigione ossea. La caratteristica saliente di questo metodo è che è semplice e non richiede troppo tempo o attrezzature sofisticate. In questo metodo, i ratti albini maschi adulti Wistar sono sta…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio centrale per la ricerca in omeopatia (CCRH), il Ministero dell’AYUSH, il governo dell’India, per il finanziamento della ricerca. Gli autori sono grati per l’aiuto e il supporto di Central Animal Facility, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto con gli esperimenti sugli animali e CMET, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto nella fotografia e nella videografia.
Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |