Summary

Protocollo per lo sviluppo di un modello di osteotomia femorale in ratti albini Wistar

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per fratturare iatrogenicamente l’asta del femore dei ratti albini Wistar e seguire lo sviluppo del callo. Questo modello di osteotomia del femore può aiutare i ricercatori a valutare il processo di guarigione delle fratture e a studiare come un farmaco potrebbe influenzare la guarigione delle fratture.

Abstract

La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l’azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti. I farmaci osteoanabolizzanti hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi elevati o effetti collaterali indesiderati. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di roditore osteotomia del femore che potesse aiutare i ricercatori a comprendere lo sviluppo della formazione di callo dopo la frattura dell’albero del femore e che potesse aiutare a stabilire se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea. I ratti albini Wistar maschi adulti sono stati utilizzati dopo l’autorizzazione del Comitato etico istituzionale per gli animali. I roditori sono stati anestetizzati e, in condizioni asettiche, sono state create fratture trasversali complete al terzo centrale degli alberi dei femori utilizzando l’osteotomia aperta. Le fratture sono state ridotte e fissate internamente utilizzando fili K intramidollari e la guarigione secondaria delle fratture è stata consentita. Dopo l’intervento chirurgico, analgesici intraperitoneali e antibiotici sono stati somministrati per 5 giorni. Le radiografie settimanali sequenziali hanno valutato la formazione di callo. I ratti sono stati sacrificati sulla base di punti temporali radiologicamente predeterminati e lo sviluppo del callo della frattura è stato analizzato radiologicamente e utilizzando l’immunoistochimica.

Introduction

L’osso è un tessuto connettivo denso costituito da cellule che formano l’osso, gli osteoblasti e le cellule che riassorbono l’osso, gli osteoclasti. La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l’azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti1. Quando c’è una frattura, l’attività osteoblastica e osteoclastica nel sito della frattura sono alcuni dei fattori importanti che determinano la guarigione ossea2. Quando la guarigione delle fratture devia dal suo corso normale, si traduce in un’unione ritardata, in una malunione o in una non unione. Una frattura si dice non unione quando c’è un fallimento dell’unione della frattura per 9 mesi, senza progressione di riparazione negli ultimi 3 mesi3. Circa il 10%-15% di tutte le fratture subisce un ritardo nella riparazione che può progredire fino alla non-unione4. Il tasso di non unione per tutte le fratture è del 5% -10% e varia a seconda dell’osso coinvolto e del sito di frattura5.

L’attuale regime per il trattamento della non unione delle fratture comprende modalità chirurgiche e/o mediche. Attualmente, il ritardo o la mancata unione delle fratture può essere superato da strategie chirurgiche come l’innesto osseo. Tuttavia, l’innesto osseo ha i suoi limiti e complicazioni come la disponibilità di tessuto di innesto, il dolore del sito donatore, la morbilità e l’infezione6. Il trattamento medico comprende farmaci osteoanabolizzanti come la proteina morfogenetica ossea (BMP) e teriparatide (analogo paratormonale). Gli agenti osteoanabolizzanti attualmente utilizzati hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi esorbitanti o effetti collaterali indesiderati7. Quindi, c’è spazio per identificare alternative economiche e non chirurgiche per la guarigione ossea. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Un farmaco noto per migliorare la guarigione ossea deve essere valutato in vitro e, se trovato promettente, può essere utilizzato per studi su modelli animali in vivo . Se il farmaco dimostra di promuovere la formazione e il rimodellamento osseo nel modello in vivo , potrebbe procedere alla fase successiva (cioè studi clinici).

Valutare la guarigione delle fratture negli animali è un passo avanti logico per valutare un nuovo agente introdotto per la guarigione ossea prima che venga sottoposto a prove umane. Per gli studi in vivo su modelli animali di guarigione delle fratture, i roditori sono diventatiun modello 8 sempre più popolare. I modelli di roditori hanno generato un crescente interesse a causa dei bassi costi operativi, della limitata necessità di spazio e del minor tempo necessario per la guarigione delle ossa9. Inoltre, i roditori hanno un ampio spettro di anticorpi e bersagli genici, che consentono studi sui meccanismi molecolari di guarigione e rigenerazione ossea10. Una riunione di consenso ha evidenziato in modo completo vari modelli di guarigione delle ossa di piccoli animali e si è concentrata sui diversi parametri che influenzano la guarigione ossea, oltre a sottolineare diversi modelli di fratture e impianti di piccoli animali11.

I modelli di frattura di base possono essere ampiamente suddivisi in modelli aperti o chiusi. I modelli di frattura chiusa utilizzano una forza di flessione a tre o quattro punti sull’osso e non richiedono un approccio chirurgico convenzionale. Portano a fratture oblique o a spirale, simili a fratture ossee lunghe negli esseri umani, ma la mancanza di standardizzazione della posizione e delle dimensioni della frattura può agire come fattore di confusione in loro12. I modelli di frattura aperti richiedono l’accesso chirurgico per l’osteotomia dell’osso, aiutano a raggiungere un modello di frattura più coerente nel sito di frattura, ma sono associati a una guarigione ritardata rispetto ai modelli chiusi13. La scelta dell’osso utilizzato per studiare la guarigione delle fratture rimane principalmente la tibia e il femore a causa delle loro dimensioni e accessibilità. La scelta del sito di frattura è di solito la diafisi o metafisi. La regione metafisaria è appositamente scelta nei casi in cui la guarigione delle fratture è studiata in soggetti osteoporotici, poiché la metafisi è più influenzata dall’osteoporosi14. Diversi impianti come perni intramidollari e fissatori esterni possono essere utilizzati per stabilizzare la frattura11,15.

L’obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un modello di roditore semplice e facile da seguire che potesse aiutare i ricercatori non solo a comprendere lo sviluppo del callo dopo la frattura del femore, ma potrebbe aiutare a determinare se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea comprendendo il meccanismo con cui agisce.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti dopo aver ottenuto l’approvazione etica dall’Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, Nuova Delhi, India (286 / IAEC-1 / 2021). 1. Procedura preoperatoria Ratti albini Wistar maschi di 6-8 settimane di età, del peso compreso tra 150-200 g ciascuno, in una struttura animale centrale (CAF) in gabbie individuali separate. Ciò garantisce l’assenza di lesioni chirurgiche / fratture quando più ratti condivido…

Representative Results

Questo studio è stato intrapreso per sviluppare un modello di osteotomia del femore in ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare la guarigione ossea, così come l’effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione ossea. Sono state seguite le precauzioni chirurgiche e i protocolli standard. Per la procedura sono stati utilizzati camici sterili, tende e attrezzature chirurgiche (Figura 1). L’apparecchiatura (Tabella 1)…

Discussion

Questo metodo descrive lucidamente i dettagli necessari per sviluppare un modello di osteotomia per frattura nei ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare l’effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione delle fratture, nonché per comprendere la complessità della guarigione ossea. La caratteristica saliente di questo metodo è che è semplice e non richiede troppo tempo o attrezzature sofisticate. In questo metodo, i ratti albini maschi adulti Wistar sono sta…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio centrale per la ricerca in omeopatia (CCRH), il Ministero dell’AYUSH, il governo dell’India, per il finanziamento della ricerca. Gli autori sono grati per l’aiuto e il supporto di Central Animal Facility, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto con gli esperimenti sugli animali e CMET, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto nella fotografia e nella videografia.

Materials

Alcohol Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India MFG/MD/2019/000189 Sterillium hand disinfectant
Artery forceps  Nebula surgical, Gujarat, India G.105.05S 5", straight
Bard-Parker handle  Nebula surgical, Gujarat, India G.103.03 Size number 3
Betadine solution Win-medicare New Delhi, India UP14250000001 10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor  Nebula surgical, Gujarat, India 908.S Small
EDTA Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 43272 Disodium salt
Eosin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 115935 For preparing the staining solution 
Forceps (plain) Nebula surgical, Gujarat, India 115.06 6", plain
Forceps (toothed) Nebula surgical, Gujarat, India 117.06 6", toothed
Formaldehyde Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 84439 For preparing the neutral buffered formalin 
Haematoxylin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 104302 For preparing the staining solution 
Hammer Nebula surgical, Gujarat, India 401.M
Injection Cefuroxime Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India 48/UA/SC/P-2013 Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial 
Injection Ketamine Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India G/28-B/6 Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL 
Injection Xylazine Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India 28/RR/AP/2009/F/G Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India  1308-B 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol  Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India MB/07/500 Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire  Nebula surgical, Gujarat, India 166 (1mm) 12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire ‎Bosch, Germany  06019F70K4 GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors  Nebula surgical, Gujarat, India G.121.06S 6", straight
Needle holder Nebula surgical, Gujarat, India G.108.06 6", straight
Ophthalmic ointment  GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India KTK/28a/467/2001 Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel) Nebula surgical, Gujarat, India 1001.S.10 10 mm, straight
Periosteal elevator  Nebula surgical, Gujarat, India 918.10.S 10 mm, straight
Pliers cum wire cutter Nebula surgical, Gujarat, India 604.65
Reynold’s scissors Nebula surgical, Gujarat, India G.110.06S 6", straight
Standard semi-synthetic diet  Ashirvad Industries, Chandigarh, India No catalog number available Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application Local purchase No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments Local purchase No catalog number available
Sterile gauze Ideal Healthcare Industries, Delhi, India  E(0047)/14/MNB/7951 Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support Local purchase No catalog number available Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 303060 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 307749 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)  Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India  334-B(H) 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15115E Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15124E Sterile, Single use
Sutures Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India SN 3318 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture 
Wax block in aluminium tray  Locally fabricated No catalog number available 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine Philips India Ltd, Gurugram, Haryana SN19861013 Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Aryal, A., Pagaku, P. K., Dey, D., Tyagi, S., Shrivastava, V., Bhattacharya, A., Rani, S., Nayak, D., Khurana, A., Khanna, P., Goyal, A., Mridha, A. R., Garg, B., Sen, S. Protocol for Developing a Femur Osteotomy Model in Wistar Albino Rats. J. Vis. Exp. (186), e63712, doi:10.3791/63712 (2022).

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