Ex Vivo Rilascio di peptide correlato al gene della calcitonina dal sistema trigeminovascolare nei roditori

L'emicrania è un disturbo neurologico che, secondo l'OMS, si stima colpisca più di 1 miliardo di persone ed è una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo¹. Pertanto, l'emicrania ha un impatto significativo sia sui pazienti che sulla società. Nonostante il recente successo clinico dei farmaci antagonisti CGRP, una grande percentuale di pazienti ha bisogno di migliori opzioni di trattamento 2,3,4,5. È necessario chiarire la fisiopatologia dell'emicrania che porta a nuovi trattamenti efficaci. La segnalazione all'interno del sistema trigeminovascolare costituito dalle meningi, dai gangli del trigemino (TG) e dal nucleo caudale del trigemino (TNC) è centrale per la fisiopatologia dell'emicrania ^6,7.

Il peptide 37 aminoacido neuropeptide calcitonina genico correlato (CGRP) è stato scoperto per la prima volta nei primi anni 1980 quando Amara e collaboratori hanno dimostrato che la trascrizione primaria dell'RNA del gene della calcitonina potrebbe essere elaborata per dare la codifica dell'mRNA per CGRP oltre alla calcitonina ^8,9. La ricerca successiva ha suggerito un collegamento con la fisiopatologia dell'emicrania¹⁰. CGRP è un neurotrasmettitore con potenti proprietà vasodilatatorie 11,12,13,14,15,16,1 ⁷, ed è ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale e periferico 13,14,18,19,20,21,22 . Il coinvolgimento di CGRP nell'emicrania è stato sottolineato con la scoperta di un aumento dei livelli di CGRP nella circolazione extracerebrale durante gli attacchi di emicrania negli esseri umani²³ e che l'infusione di CGRP provoca dolore simile all'emicrania nei pazienti²⁴. Due anni dopo, il primo studio proof-of-concept sull'efficacia dell'antagonista CGRP olcegepant nel trattamento dell'emicrania è stato pubblicato²⁵.

La CGRP è abbondante nel sistema trigeminovascolare come dimostrato nel TG^21,26, nelle fibre nervose sensoriali che innervano la dura madre^27,28,29 e nella TNC³⁰. Nel sistema trigeminovascolare, CGRP si trova nei neuroni di piccole e medie dimensioni del TG, nelle fibre C non mielinizzate, ed è espresso in quasi il 50% della popolazione neuronale del TG. Il recettore CGRP è espresso principalmente nei neuroni più grandi e si trova nelle fibre Aδ mieliniche^31,32. CGRP viene rilasciato dai neuroni dopo stimolazione chimica o elettrica^33,34. Gli studi sui percorsi che portano al rilascio di CGRP e la posizione di questa attivazione sono cruciali per comprendere la fisiopatologia dell'emicrania. Nel corso degli ultimi 5 decenni, gli studi preclinici hanno contribuito ad acquisire ampie conoscenze sulla segnalazione correlata all'emicrania e hanno contribuito allo sviluppo di nuovi trattamenti³⁵. Molti metodi che considerano il coinvolgimento vascolare e neurogeno sono stati modificati e applicati nella ricerca sull'emicrania. Si possono citare modelli in vivo e in vitro di risposte arteriose a composti biologici o trattamenti farmacologici^17,36,37 e stimolazione nervosa elettrica ^38,39. Inoltre, i neuroni attivati nella TNC possono essere rilevati dall'espressione di c-Fos 40,41,42 e dalle registrazioni elettrofisiologiche in quest'area ^43,44. Entrambi i metodi misurano i segnali nocicettivi trasmessi al cervello dalla testa, ad esempio la dura madre. L'uso di un solo modello preclinico non presenta il quadro completo della fisiopatologia dell'emicrania. Pertanto, è importante combinare diversi modelli che coprano il maggior numero possibile di aspetti della fisiopatologia dell'emicrania. Il continuo sviluppo di nuovi modelli coprirà vari aspetti dei meccanismi dell'emicrania e nel tempo verrà scoperto il mistero della fisiopatologia dell'emicrania.

Qui, viene presentato un protocollo dettagliato del metodo di rilascio CGRP, eseguito ex vivo in TG e TNC isolati da topi dopo stimolazione chimica. Il rilascio di CGRP può anche essere studiato nella dura madre dai ratti. Pertanto, nel protocollo sperimentale per i ratti, la dura madre è descritta insieme a TG e TNC. La base per il metodo di rilascio CGRP è stata descritta per la prima volta nel 1999, quando Ebersberger e collaboratori hanno condotto ricerche pionieristiche e hanno scoperto che CGRP è stato rilasciato dalla dura madre dopo stimolazione chimica ed elettrica delle afferenze durali nei ratti⁴⁵. Successivamente, questo approccio è stato esteso al rilascio CGRP dal TG⁴⁶ e dal TNC⁴⁷. Successivamente, il metodo è stato modificato per essere applicato a TG e TNC nei topi. Finora, il rilascio di CGRP dalla dura madre è stato impegnativo nei topi.

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state eseguite in conformità alla guida della Comunità Europea per la cura e l'uso degli animali (2010/63/UE). Topi maschi C57BL/6JBomTac, di 10 settimane, e ratti maschi Sprague Dawley, di 10 settimane, sono stati utilizzati per dimostrare questo protocollo.

1. Preparazione del liquido interstiziale sintetico

1. Preparare il liquido interstiziale sintetico (SIF) secondo la seguente ricetta: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO₃, 11,70 mM NaH 2 PO₄, 1,50 mM CaCl₂, 9,60 mM Na-gluconato, 5,50 mM glucosio e 7,60 mM saccarosio (vedi tabella dei materiali).
   NOTA: La SIF può essere variata a seconda del target di stimolazione, ad esempio, una soluzione priva di calcio può essere utilizzata quando si studiano i canali del calcio.
2. Regolare il pH a 7,4 e stabilizzare il pH mediante gassificazione del carbogeno (5% CO 2 e 95% O₂)⁴⁶.

2. Eutanasia

1. Anestetizzare topi e ratti adulti con una miscela di 70% CO 2 e 30% O₂. Decapitare topi usando un paio di forbici e ratti usando una ghigliottina (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Utilizzare un ceppo e un'età adatti allo scopo della ricerca. Sia i maschi che le femmine possono essere utilizzati in questo modello.
2. Separare la testa dal corpo a livello C3-C4 del midollo spinale.
   NOTA: L'eutanasia può essere eseguita anche con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100-150 mg/kg).

3. Dissezione

1. Preparare il tessuto di ratto seguendo i passaggi seguenti.
   1. Rimuovere la pelle e il muscolo intorno alla testa e al collo usando un paio di forbici (Figura 1A).
   2. Utilizzare un tagliaossa e forbici per separare le mascelle inferiori dalla testa (Figura 1B-C).
   3. Aprire il midollo spinale inserendo un trimmer osseo caudalmente nella parte dorsale delle vertebre e rimuovere la parte dorsale delle vertebre per esporre il midollo spinale e il tronco cerebrale (Figura 1D).
   4. Tagliare la parte caudale del cranio dai bordi delle ossa occipitale e interparietale per rimuovere queste strutture ossee che espongono il cervelletto (Figura 1E).
      NOTA: È importante non danneggiare il tronco cerebrale e il midollo spinale durante il taglio e la rimozione delle vertebre.
   5. Isolare la TNC (Sp5C) che scorre caudalmente a circa 13-16 mm dal bregma su ciascun lato tagliando la parte dorsolaterale del tronco encefalico con forbici a molla. Immergere il TNC sinistro e destro in SIF (Figura 1E-I).
      NOTA: La descrizione corrisponde a ratti adulti.
   6. Tagliare la testa a metà del conflitto per dividere il cranio in due usando una sega (Figura 1J-L).
   7. Rimuovere con cautela il cervello senza toccare la dura madre attaccata al cranio usando una spatola e tagliando il nervo trigemino dove entra nel tronco cerebrale (Figura 1M-P).
   8. Per isolare il TG, taglialo, compresi i suoi rami attorno ai confini visivi. Tagliare il ramo mandibolare dove entra nel forame ovale. Tagliare i rami oftalmici e mascellari entrando nel cranio in quanto non sono divisi macroscopicamente. Durante la dissezione del TG, rimuovere la dura madre che copre il TG (Figura 1Q-T).
   9. Immergere le metà del cranio e i TG in SIF.
2. Preparare il tessuto del topo seguendo i passaggi seguenti.
   1. Rimuovere la pelle e i muscoli intorno alla testa e al collo usando piccole forbici (Figura 2A-B).
   2. Aprire il midollo spinale inserendo un paio di piccole forbici caudalmente nella parte dorsale delle vertebre e rimuovere la parte dorsale delle vertebre per esporre il midollo spinale e il tronco cerebrale (Figura 2C).
      NOTA: È importante non danneggiare il midollo spinale durante il taglio e la rimozione delle vertebre.
   3. Tagliare il cranio dai bordi delle ossa occipitale e interparietale per rimuovere queste strutture ossee che espongono il cervelletto (Figura 2D-F).
   4. Quindi, tagliare l'osso parietale a metà del sagitto e rimuovere l'osso per esporre il cervello (Figura 2G-I).
   5. Rimuovere con attenzione il cervelletto con una spatola per esporre il tronco cerebrale (Figura 2J).
   6. Isolare la parte del tronco cerebrale contenente TNC usando forbici a molla (Figura 2K-N). Immergere il tronco encefalico con TNC in SIF (Figura 2O).
   7. Rimuovere il cervello e tagliare il nervo trigemino dove entra nel tronco cerebrale (Figura 2P-Q).
   8. Per isolare il TG, taglialo, compresi i suoi rami attorno ai confini visivi. Tagliare il ramo mandibolare dove entra nel forame ovale. Tagliare i rami oftalmici e mascellari entrando nel cranio in quanto non sono divisi macroscopicamente. Durante la dissezione del TG, rimuovere la dura madre che copre il TG (Figura 2R-S).
   9. Immergere i TG nella SIF (Figura 2T).

4. Lavaggio

1. Lavare le metà del cranio, le TNC e i TG in SIF per 30 minuti sostituendo il SIF ogni 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Le fasi di lavaggio possono essere eseguite mantenendo il tessuto in contenitori di plastica con un coperchio in tulle per consentire una facile sostituzione del SIF (Figura 3A-B).
2. Preparare il tessuto di ratto seguendo i passaggi seguenti.
   1. Trasferire le metà TNC in tappi di tubi per microcentrifuga separati con 350 μL di SIF (Figura 3C).
   2. Trasferire i TG ai tappi dei tubi della microcentrifuga - un TG per tappo del tubo della microcentrifuga con 350 μL di SIF (Figura 3C).
   3. Posizionare le metà del cranio su piattaforme di argilla o una piastra di coltura a 6 pozzetti e riempire il cranio con 400 μL di SIF (Figura 3C).
3. Preparare il tessuto del topo seguendo i passaggi seguenti.
   1. Trasferire il tronco encefalico con TNC in un tappo a tubo per microcentrifuga con 250 μL di SIF (Figura 3D).
   2. Trasferire i due TG su un tappo a tubo per microcentrifuga con 250 μL di SIF (Figura 3D).
      NOTA: Posizionare due TG per tappo del tubo della microcentrifuga quando si utilizza tessuto di topi.
4. Collocare teschi di ratto e tappi di tubo di microcentrifuga con tessuto di ratto e topo in un'incubatrice umidificata a 37 °C. Sostituire SIF utilizzando una pipetta ogni 5 minuti per 20 minuti.
   NOTA: è importante non toccare il tessuto quando si aggiunge e si rimuove SIF.

5. Test antidroga

1. Determinare i livelli di rilascio basale di CGRP.
   1. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 250 μL di SIF al mouse TG e TNC. Aggiungere 350 μL a TG e TNC di ratto e 400 μL a ciascun cranio di ratto.
   2. Dopo 10 minuti di incubazione, raccogliere 200 μL del campione in una provetta da microcentrifuga e aggiungere 50 μL di tampone EIA 10x (fornito con il kit di dosaggio immunoenzimatico CGRP, vedere Tabella dei materiali) per consentire la misurazione del rilascio basale di CGRP (fase 6). Eliminare il liquido rimanente.
      NOTA: Il tempo di incubazione deve essere lo stesso per tutti i campioni.
   3. Conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
   4. Dopo il campionamento dei livelli di rilascio basale di CGRP, seguire uno dei tre metodi: (A) Stimolazione singola (fase 5.2); (B) Stimolazione concentrazione-risposta (fase 5.3); e (C) Inibizione della stimolazione (fase 5.4) (Figura 4).
      NOTA: Il composto in esame e le concentrazioni utilizzate dipendono dallo scopo dello studio.
2. Eseguire una singola stimolazione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aggiungere il composto in esame o il veicolo al tessuto e lasciarlo per 10 minuti (volume: 250 μL per il topo TG e TNC, 350 μL per il ratto TG e TNC e 400 μL per ciascun cranio di ratto).
   2. Dopo 10 minuti di incubazione, raccogliere 200 μL del campione in una provetta da microcentrifuga con 50 μL di tampone EIA 10x. Eliminare il liquido rimanente e conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
      NOTA: Il tempo di incubazione deve essere lo stesso per tutti i campioni.
3. Eseguire la stimolazione concentrazione-risposta seguendo i passaggi seguenti.
   1. Diluire il composto in esame o il veicolo alle concentrazioni desiderate. Aggiungere il composto in esame in concentrazioni crescenti a partire dalla concentrazione più bassa.
      NOTA: Il composto in esame e le concentrazioni utilizzate dipendono dallo scopo dello studio. Ad esempio, per il presente studio sono stati utilizzati 1 μM, 10 μM e 100 μM di supercinnamaldeide.
   2. Aggiungere la concentrazione più bassa (1 μM per il presente studio) del composto in esame e del veicolo corrispondente a due preparati tissutali identici e incubare per 10 minuti (volume: 250 μL per il tessuto di topo, 350 μL per il ratto TG e TNC e 400 μL per ciascun cranio di ratto).
   3. Dopo 10 minuti di incubazione, raccogliere 200 μL del campione in una provetta da microcentrifuga con 50 μL di tampone EIA 10x.
   4. Eliminare il liquido rimanente e aggiungere la seconda concentrazione più bassa (10 μM per il presente studio) al tessuto.
   5. Conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
   6. Ripetere questa procedura con le concentrazioni rimanenti (100 μM per il presente studio).
4. Eseguire l'inibizione della stimolazione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aggiungere il bloccante o il veicolo al tessuto e incubare per 10 minuti (volume: 250 μL per il tessuto di topo, 350 μL per il ratto TG e TNC e 400 μL per ogni cranio di ratto).
      NOTA: Il bloccante e la concentrazione utilizzati dipendono dallo scopo dello studio. Ad esempio, è stata utilizzata glibenclamide da 3 μM per il risultato rappresentativo nella Figura 5.
   2. Dopo 10 minuti di incubazione, prelevare un campione da 200 μL in una provetta da microcentrifuga con 50 μL di tampone EIA 10x. Eliminare il liquido rimanente e conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
   3. Aggiungere l'agonista o l'agonista + bloccante (vedi Tabella dei materiali) al tessuto e incubare per 10 minuti.
      NOTA: L'agonista, il bloccante e le concentrazioni utilizzati dipendono dallo scopo dello studio. Nel presente studio sono stati utilizzati 3 μM di glibenclamide e 1 μM di capsaicina, Figura 5.
   4. Dopo 10 minuti di incubazione, prelevare un campione da 200 μL in una provetta da microcentrifuga con 50 μL di tampone EIA 10x. Eliminare il liquido rimanente e conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
5. Eseguire un controllo positivo per l'esperimento.
   1. Quando appropriato, aggiungere un controllo positivo (ad esempio, 1-10 μM di capsaicina, vedere Tabella dei materiali) al tessuto alla fine del protocollo e raccogliere un campione di 200 μL in una provetta da microcentrifuga con 50 μL di tampone EIA 10x dopo un periodo di incubazione di 10 minuti.
      NOTA: è vantaggioso includere un controllo positivo per garantire che la configurazione e i tessuti funzionino. La capsaicina 48,49,50 o lo stimolo depolarizzante del potassio (40-60 mM di KCl)^46,47,49 sono abitualmente utilizzati per causare il rilascio di CGRP dal sistema trigeminovascolare. 40-60 mM di KCl SIF vengono preparati come SIF, tranne che NaCl viene scambiato con KCl su base equimolare.

6. Analisi delle concentrazioni di CGRP

1. Misurare la quantità di CGRP rilasciata utilizzando un kit di dosaggio immunoenzimatico (EIA) seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
2. Misurare la densità ottica a 410 nm utilizzando un fotometro a piastre. Se si utilizza un kit CGRP EIA diverso, misurare la densità ottica alla lunghezza d'onda fornita nel protocollo del produttore.
   NOTA: i campioni devono essere diluiti in modo che corrispondano alla curva standard.
3. Eseguire l'analisi dei dati.
   1. Presentare i dati come concentrazioni assolute o normalizzare il rilascio basale di CGRP dal tessuto specifico.

Questa tecnica è uno strumento per studiare i meccanismi molecolari correlati al CGRP coinvolti nell'emicrania. Ha il vantaggio di valutare il rilascio di CGRP da diversi livelli del sistema trigeminovascolare e può essere applicato sia su topi e ratti wild-type che transgenici in combinazione con vari composti farmacologici. Qui vengono presentati esperimenti concentrazione-risposta e blocco da ratti e risultati concentrazione-risposta da topi wild-type e transgenici.

Il metodo di rilascio di CGRP è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'inibitore del canale KATP glibenclamide sul rilascio di CGRP da TG e dura madre in ratti allodinici trigeminali spontanei (STA) femmine. In primo luogo, la concentrazione ottimale di capsaicina è stata trovata utilizzando un disegno di studio concentrazione-risposta. L'esposizione alla capsaicina ha indotto un significativo rilascio di CGRP dalla dura madre e dal TG rispetto al veicolo (Figura 5). Nella dura madre, il rilascio massimo di CGRP è stato trovato a 1 μM di capsaicina, e in TG, il rilascio massimo di CGRP è stato trovato a 10 μM di capsaicina (Figura 5A-B). Sulla base degli esperimenti concentrazione-risposta, sono stati utilizzati 1 μM di capsaicina e 3 μM di glibenclamide per esperimenti di blocco. La glibenclamide non ha mostrato alcun effetto sul rilascio basale di CGRP da dura madre (P = 0,441) e TG (P = 0,881) quando analizzata con ANOVA51 unidirezionale. La glibenclamide ha ridotto significativamente il rilascio di CGRP indotto da capsaicina nella dura madre del 40% (P = 0,031) e il TG del 39% (P = 0,003) rispetto alla capsaicina nel veicolo quando analizzato con un ANOVA unidirezionale (Figura 5C-D)51.

Nei topi, il protocollo è stato utilizzato per esaminare il coinvolgimento del canale ionico del potenziale recettore transitorio anchirina 1 (TRPA1) in un modello murino GTN di emicrania, in cui l'ipersensibilità indotta da GTN era completamente dipendente dai canali TRPA1. È stato riscontrato che l'agonista TRPA1 supercinnamaldeide (SCA) rilascia CGRP in modo dose-dipendente dal TG con 1 μM, 10 μM e 100 μM di SCA, risultando in 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) e 69% (P = 0,0097) aumento del rilascio di CGRP rispetto al veicolo, rispettivamente quando analizzato con ANOVA a due vie. Questo rilascio era assente in TG da topi nulli Trpa1 in cui l'esposizione a 1 μM, 10 μM e 100 μM di SCA ha determinato una variazione percentuale dell'11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) e del 9% (P = 0,97) nel rilascio di CGRP rispetto al veicolo, rispettivamente quando analizzata con ANOVA bidirezionale. La successiva stimolazione con 10 μM di capsaicina (controllo positivo) mostra che tutti i campioni di tessuto potrebbero rilasciare CGRP (Figura 6)50.

Figura 1: Dissezione passo-passo del tessuto dai ratti. I dettagli (A-T) sono forniti nella sezione protocollo (passaggio 3.1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Dissezione passo-passo del tessuto dai topi. I dettagli (A-T) sono forniti nella sezione protocollo (passaggio 3.2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Lavaggio e incubazione del tessuto dei roditori. (A-B) Tessuto appena isolato in contenitori di plastica con SIF. I contenitori sono rivestiti in tulle per consentire un facile cambio di SIF. (C) Tessuto di ratto - Due metà del cranio con dura madre che coprono i rivestimenti interni del cranio poste su una piastra di coltura a 6 pozzetti. Il nucleo caudale del trigemino destro e sinistro in coperchi di tubi di microcentrifuga separati (fila superiore di coperchi). I due gangli del trigemino nei singoli coperchi dei tubi della microcentrifuga (fila inferiore di coperchi). (D) Tessuto di topo - La parte del tronco cerebrale contenente il nucleo caudale del trigemino in un coperchio separato del tubo di microcentrifuga (in alto). Due gangli del trigemino di topo sono in un coperchio del tubo della microcentrifuga (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Progetti di studio per il rilascio di CGRP. Tre diversi protocolli per l'esecuzione di esperimenti di rilascio CGRP. I farmaci devono essere diluiti nel liquido interstiziale sintetico (SIF). (A) Stimolazione singola. (B) Stimolazione concentrazione-risposta. (C) Inibizione di una stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: La glibenclamide inibisce il rilascio di CGRP indotto dalla capsaicina dalla dura madre e dal ganglio trigemino del ratto. I livelli di CGRP dal ganglio trigemino e dalla dura madre isolati da ratti allodinici trigeminali spontanei (STA) femmina (215-318 g) originariamente provenienti dalla Thomas Jefferson University52 sono stati misurati con kit CGRP EIA umani commerciali. (A-B) Rilascio di CGRP da (A) dura madre e (B) ganglio trigemino dopo aumento delle concentrazioni di capsaicina (10 nM, 100 nM, 1 μM e 10 μM) (n = 4). I dati sono presentati come singoli punti e sono stati analizzati con ANOVA bidirezionale. p < 0,0001 (C-D) Livelli di CGRP rilasciati da (C) dura madre e (D) ganglio trigemino dopo 10 minuti di esposizione al veicolo, 3 μM glibenclamide (glib), 1 μM capsaicina e 1 μM capsaicina + 3 μM glib (n = 6-11). I dati sono presentati come singoli punti e valori medi e sono stati analizzati con ANOVA unidirezionale. *rispetto al veicolo. #capsaicina rispetto a capsaicina + glib. #P < 0,05, ** e ##P < 0,01, ****P < 0,0001. Le analisi sono state seguite con il test di confronto multiplo di Bonferroni. Per tutti i test è stato utilizzato un livello significativo di α = 0,05. Questa cifra è stata modificata da Christensen et al. 51. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: L'esposizione alla SCA provoca il rilascio di CGRP dipendente da TRPA1 dal ganglio trigemino del topo. I livelli di CGRP rilasciati dal ganglio trigemino isolato da WT e Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 topi maschi (8-10 settimane) sono stati misurati con kit CGRP EIA di ratto dopo esposizione a supercinnamaldeide (SCA) a 1 μM, 10 μM e 100 μM e capsaicina a 10 μM come controllo positivo (n = 6). I dati di ciascun mouse sono presentati come singoli punti e le barre indicano i valori medi. Statistiche: Il confronto tra SCA e veicolo ad ogni concentrazione e tra controllo basale e positivo è stato eseguito con un ANOVA ripetuto a due vie. Un livello significativo di α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Questa cifra è stata modificata da Christensen et al. 50. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.