Summary

Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Published: July 20, 2022
doi:

Summary

Questo documento presenta un metodo per costruire e gestire un sistema di coltura cellulare a perfusione multicanale a basso costo per misurare la dinamica dei tassi di secrezione e assorbimento dei soluti nei processi cellulari. Il sistema può anche esporre le cellule a profili di stimolo dinamici.

Abstract

Alcune funzioni cellulari e tissutali operano all’interno della scala temporale dinamica da minuti a ore che sono scarsamente risolte dai sistemi di coltura convenzionali. Questo lavoro ha sviluppato un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo che consente di perfondere continuamente il terreno di coltura in un modulo di coltura cellulare e frazionato in un modulo a valle per misurare la dinamica su questa scala. Il sistema è costruito quasi interamente da parti disponibili in commercio e può essere parallelizzato per condurre esperimenti indipendenti in piastre di coltura cellulare multi-pozzo convenzionali contemporaneamente. Questo articolo video illustra come assemblare la configurazione di base, che richiede solo una singola pompa a siringa multicanale e un collettore di frazioni modificato per perfondere fino a sei colture in parallelo. Vengono inoltre presentate varianti utili sul design modulare che consentono dinamiche di stimolazione controllate, come impulsi di soluto o profili simili a farmacocinetici. È importante sottolineare che, poiché i segnali dei soluti viaggiano attraverso il sistema, vengono distorti a causa della dispersione del soluto. Inoltre, viene descritto un metodo per misurare le distribuzioni del tempo di residenza (RTD) dei componenti della configurazione della perfusione con un tracciante utilizzando MATLAB. Gli RTD sono utili per calcolare come i segnali dei soluti sono distorti dal flusso nel sistema multi-compartimento. Questo sistema è altamente robusto e riproducibile, quindi i ricercatori di base possono facilmente adottarlo senza la necessità di strutture di fabbricazione specializzate.

Introduction

Molti importanti processi biologici si verificano in colture cellulari e tissutali sulla scala temporale da minuti a ore 1,2,3. Mentre alcuni di questi fenomeni possono essere osservati e registrati in modo automatizzato utilizzando la microscopia time-lapse4, la bioluminescenza1 o altri metodi, gli esperimenti che coinvolgono la raccolta di campioni di surnatante di coltura per l’analisi chimica vengono spesso eseguiti manualmente in colture cellulari statiche. Il campionamento manuale limita la fattibilità di alcuni studi a causa dell’inconveniente di punti temporali di campionamento frequenti o fuori orario. Ulteriori carenze dei metodi di coltura statica includono esperimenti che coinvolgono esposizioni controllate e transitorie a stimoli chimici. Nelle colture statiche, gli stimoli devono essere aggiunti e rimossi manualmente, e i profili di stimolo sono limitati ai cambiamenti di passo nel tempo, mentre i cambiamenti medi aggiungono e rimuovono anche altri componenti del mezzo, che possono influenzare le cellule in modo incontrollato5. I sistemi fluidici possono superare queste sfide, ma i dispositivi esistenti pongono altre sfide. I dispositivi microfluidici comportano i costi proibitivi di attrezzature specializzate e formazione da produrre e utilizzare, richiedono metodi microanalitici per elaborare i campioni e le cellule sono difficili da recuperare dai dispositivi dopo la perfusione6. Pochi sistemi macrofluidici sono stati creati per i tipi di esperimenti qui descritti 7,8,9,10, e sono costruiti con più parti personalizzate realizzate internamente e richiedono più pompe o collettori di frazioni. Inoltre, gli autori non sono a conoscenza di alcun sistema di coltura cellulare a perfusione macrofluidica disponibile in commercio diverso dai bioreattori a serbatoi agitati per la coltura in sospensione, che sono utili per la bioproduzione, sebbene non siano progettati per modellare e studiare la fisiologia.

Gli autori hanno precedentemente riferito sulla progettazione di un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo composto quasi interamente da parti11 disponibili in commercio. La versione base del sistema consente di conservare più colture in una piastra di pozzo in un incubatore a CO2 e di fondere continuamente con il mezzo di una pompa a siringa, mentre i flussi del mezzo effluente provenienti dalle colture vengono automaticamente frazionati in campioni nel tempo utilizzando un collettore di frazioni con una modifica personalizzata. Pertanto, questo sistema consente il campionamento automatizzato del surnatante del terreno di coltura e l’input continuo del soluto alle colture nel tempo. Il sistema è macrofluidico e modulare e può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze di nuovi progetti di esperimenti.

L’obiettivo generale del metodo qui presentato è quello di costruire, caratterizzare e utilizzare un sistema di coltura cellulare a perfusione che consenta esperimenti in cui vengono misurati i tassi di secrezione o assorbimento di sostanze da parte delle cellule nel tempo e / o le cellule sono esposte a segnali di soluto precisi e transitori. Questo articolo video spiega come assemblare la configurazione di base, che è in grado di perfondere fino a sei colture cellulari contemporaneamente utilizzando una singola pompa a siringa e un collettore di frazioni modificate. Nella Figura 1 sono inoltre presentate due varianti utili sul sistema di base che utilizzano pompe e parti aggiuntive per consentire esperimenti che espongono le cellule a segnali transitori di concentrazione di soluto, inclusi brevi impulsi e profili farmacocinetici12.

Figure 1
Figura 1: Tre variazioni sul progetto del sistema di perfusione. (In alto) Il sistema di perfusione di base. (Al centro) Il sistema di perfusione con un rubinetto di arresto per più sorgenti medie. (In basso) Il sistema di perfusione con un serbatoio agitato per imitare un volume di distribuzione ben miscelato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A causa della dispersione e della diffusione all’interno del flusso, i segnali del soluto diventano distorti o “imbrattati” mentre viaggiano attraverso il sistema di flusso. Questa distorsione può essere quantificata mediante l’uso di distribuzioni temporali di residenza (RTD)13. Questo articolo spiega come eseguire esperimenti traccianti sui componenti del sistema di perfusione (Figura 2) e fornisce script MATLAB per generare RTD dai dati misurati. Una spiegazione dettagliata di questa analisi può essere trovata nel precedente articolo11 degli autori. Ulteriori script MATLAB adattano funzioni appropriate agli RTD ed estraggono parametri fisici ed eseguono la convoluzione del segnale utilizzando RTD per prevedere come l’input del segnale di soluto da parte dell’utente si propagherà e si distorcerà attraverso il sistema di perfusione14.

Figure 2
Figura 2: Distribuzioni del tempo di residenza. Gli RTD dei componenti del sistema di flusso, come questa lunghezza del tubo, vengono misurati immettendo un impulso di tracciante nel sistema e misurando come “spalma” nel momento in cui esce nelle frazioni raccolte. Questa cifra è stata modificata da Erickson et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparare le parti per la perfusione della piastra del pozzo Preparare i tubi Tagliare due lunghezze di tubi in silicone (diametro interno 1,6 mm) per ogni coltura cellulare da perfusare. Assicurarsi che il pezzo utilizzato come tubo a monte sia abbastanza lungo da raggiungere dalla pompa della siringa alla coltura cellulare all’interno dell’incubatore e che il pezzo a valle possa raggiungere dalla coltura cellulare alla posizione più estesa del collettore di frazione. Da…

Representative Results

Il sistema di perfusione con più sorgenti medie della sezione 5 del protocollo è stato utilizzato per misurare le dinamiche di espressione di un gene reporter guidato dal fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer del fattore di trascrizione delle cellule B attivate (NF-κB) nelle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) in risposta a un impulso di 1,5 ore del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le cellule HEK293 sono state stabilmente trasdotte utilizzando vettori lentivirali con un costrutto genico cont…

Discussion

Questo lavoro descrive l’assemblaggio e il funzionamento di un sistema di coltura cellulare a perfusione con più sorgenti medie dimostrate con un esempio specifico in cui sono state misurate le dinamiche dell’espressione genica guidata da NF-κB in risposta a un impulso transitorio di TNF-α. Gli RTD dei componenti del sistema di perfusione sono stati misurati e modellati e la convoluzione del segnale è stata utilizzata per prevedere sia l’esposizione delle cellule all’impulso TNF-α sia la distribuzione TNF-α nelle f…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata condotta con il supporto di Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 e T32 GM008339 del National Institutes of Health.

Materials

18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines Grainger 5FVK2
293T Cells ATCC CRL-3216 HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning VWR 89091-010 Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL Fisher Scientific 14-829-45
BioFrac Fraction Collector  Bio-Rad 7410002 Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" McMaster-Carr 4615T93 This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native NanoLight Technology 303 Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells Millipore Sigma CLS3548 Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells Fisher Scientific 720081 Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 11965126
Epilog Zing 24 Laser Cutting Edge Systems Epilog Zing 24 Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL Fisher Scientific 14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL Fisher Scientific 14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129 Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End Fisher Scientific 14-961-26 Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered Fisher Scientific 2707410 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 21600010 Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker Marshall Scientific Labline 4625 Titer Shaker Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK Cole-Parmer EW-30600-04 Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK Masterflex UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" Cole-Parmer EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID Cole-Parmer EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK Masterflex EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft Masterflex EW-96410-14
MATLAB MathWorks R2019b Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600
Rack Set F1 Bio-Rad 7410010 Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF Bio-Techne 10291-TA-020 Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm Saint Gobain DX263015-50 Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm Saint Gobain DX263027-10 Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L Spectrum Chemicals S-395-1LT
SolidWorks Dassault Systems SolidWorks CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader ThermoFisher Scientific VL0000D0 Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue Michaels 10404779 Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.

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Citazione di questo articolo
Erickson, P., Doshi, A., Jetley, G., Amin, P., Mejevdiwala, A., Patel, A., Bento, R., Parekkadan, B. Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (185), e63935, doi:10.3791/63935 (2022).

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