Summary

Imaging PET/RM non invasivo in un modello murino ortotopico di carcinoma epatocellulare

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per creare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare ortotopico con e senza legatura dell’arteria epatica ed eseguire la tomografia ad emissione di positroni (PET) non invasiva dell’ipossia tumorale utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG).

Abstract

I modelli sperimentali preclinici di carcinoma epatocellulare (HCC) che ricapitolano la malattia umana rappresentano uno strumento importante per studiare la tumorigenesi e valutare nuovi approcci terapeutici. L’imaging non invasivo di tutto il corpo utilizzando la tomografia ad emissione di positroni (PET) fornisce informazioni critiche sulle caratteristiche in vivo dei tessuti a livello molecolare di tempo reale. Presentiamo qui un protocollo per la creazione di xenotrapianto ortotopico HCC con e senza legatura dell’arteria epatica (HAL) per indurre ipossia tumorale e la valutazione del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) PET / risonanza magnetica (MR). L’ipossia tumorale poteva essere facilmente visualizzata usando il marcatore di ipossia [18 F] FMISO, e si è scoperto che l’assorbimento di [18 F] FMISO era più alto nei topi HCC sottoposti a HAL rispetto al gruppo non-HAL, mentre [18F] FDG non poteva distinguere l’ipossia tumorale tra i due gruppi. I tumori HAL hanno anche mostrato un livello più elevato di espressione del fattore inducibile dall’ipossia (HIF)-1α in risposta all’ipossia. La quantificazione dei tumori HAL ha mostrato un aumento di 2,3 volte nell’assorbimento di [18F] FMISO basato sull’approccio standardizzato di assorbimento del valore (SUV).

Introduction

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il sesto tumore più diagnosticato e la terza causa più comune di morte per cancro in tutto il mondo, con oltre 900.000 nuovi casi e 800.000 decessi nel 20201. Il principale fattore di rischio è la cirrosi, che si verifica a seguito di infezioni virali (virus dell’epatite B e C), abuso di alcol, diabete e steatoepatite non alcolica2. La gestione dell’HCC è piuttosto complessa e sono disponibili diverse opzioni di trattamento, tra cui resezione chirurgica, ablazione termica o chimica, trapianto, chemioembolizzazione transarteriosa, radiazioni e chemioterapia, a seconda della stadiazione della malattia 2,3. L’HCC è un tumore refrattario alla chemioterapia con recidiva della malattia fino al 70% dei pazienti che seguono una terapia curativa2.

Nonostante l’elevato grado di eterogeneità tumorale, l’HCC è associato a due esiti comuni: (i) l’HCC è molto ipossico e (ii) l’ipossia tumorale è legata a una maggiore aggressività del tumore e al fallimento del trattamento. La proliferazione incontrollata delle cellule HCC si traduce in un alto tasso di consumo di ossigeno che precede la vascolarizzazione, creando così un microambiente ipossico. Bassi livelli di ossigeno intratumorale innescano quindi una serie di risposte biologiche che influenzano l’aggressività del tumore e la risposta al trattamento. I fattori inducibili dall’ipossia (HIF) sono spesso riconosciuti come i regolatori trascrizionali essenziali nella risposta all’ipossia 2,3. Quindi, la capacità di rilevare l’ipossia è fondamentale per visualizzare i tessuti neoplastici e identificare i siti inaccessibili, che richiedono procedure invasive. Aiuta anche a comprendere meglio i cambiamenti molecolari che portano all’aggressività del tumore e migliorare i risultati del trattamento del paziente.

L’imaging molecolare mediante tomografia ad emissione di positroni (PET) è comunemente usato nella diagnosi e nella stadiazione di molti tumori, incluso l’HCC. In particolare, l’uso combinato dell’imaging PET a doppio tracciante che coinvolge [18 F]fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) e [11C]acetato può aumentare significativamente la sensibilità complessiva nella diagnosi di HCC 4,5. L’imaging dell’ipossia, d’altra parte, può essere ottenuto utilizzando il marcatore ipossico comunemente usato [18 F] Fluoromisonidazolo ([18F] FMISO). Nella pratica clinica, la valutazione non invasiva dell’ipossia è importante per differenziare tra vari tipi di tumori e regioni per la pianificazione della radioterapia6.

L’imaging preclinico è diventato uno strumento indispensabile per la valutazione non invasiva e longitudinale di modelli murini per diverse malattie. Un modello di HCC robusto e altamente riproducibile rappresenta un’importante piattaforma per la ricerca preclinica e traslazionale sulla fisiopatologia dell’HCC umano e la valutazione di nuove terapie. Insieme all’imaging PET, i comportamenti in vivo possono essere chiariti per fornire importanti informazioni a livello molecolare per un dato punto temporale. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di xenotrapianti HCC ortotopici di legatura dell’arteria epatica (HAL) e l’analisi del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. L’incorporazione di HAL rende un modello adatto di xenotrapianti di topi HCC transgenici o indotti chimicamente per studiare l’ipossia tumorale in vivo, poiché HAL può bloccare efficacemente l’afflusso di sangue arterioso per indurre ipossia intratumorale 7,8. Inoltre, a differenza della colorazione immunoistochimica ex vivo con pimonidazolo, i cambiamenti nel metabolismo tumorale a seguito di ipossia possono essere facilmente visualizzati e quantificati con precisione in modo non invasivo utilizzando l’imaging PET, consentendo la valutazione longitudinale della risposta al trattamento o la misurazione dell’emergenza di resistenza 3,7,8 . Il nostro metodo mostrato qui consente la creazione di un robusto modello di HCC ipossico insieme al monitoraggio non invasivo dell’ipossia tumorale utilizzando l’imaging PET / MR per studiare la biologia dell’HCC in vivo.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con il Comitato sull’uso di animali vivi nell’insegnamento e nella ricerca (CULATR) presso il Centre for Comparative Medicine Research (CCMR) dell’Università di Hong Kong, un programma accreditato dall’Associazione per la valutazione e l’accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (AAALAC). Gli animali utilizzati nello studio erano topi femmina BALB/cAnN-nu (Nude) all’età di 6-8 settimane, pesati a 20 g ± 2 g. Cibo e acqua erano…

Representative Results

Per ottenere un blocco tumorale adatto per il successivo impianto ortotopico, cloni stabili sono stati prima generati mediante iniezione sottocutanea di 200 μL di sospensione cellulare in DPBS (contenente cellule MHCC97L) nel fianco inferiore di topi nudi (Figura 1A). La crescita del tumore è stata monitorata e, quando le dimensioni del tumore hanno raggiunto 800-1000 mm 3 (circa 4 settimane dopo l’iniezione), i topi sono stati eutanasizzati e il blocco tumorale risultante è st…

Discussion

In questo studio, abbiamo descritto le procedure per eseguire HAL su xenotrapianti ortotopici HCC epatici utilizzando tumori sottocutanei, insieme a metodi per il monitoraggio non invasivo dell’ipossia tumorale negli xenotrapianti ortotopici utilizzando [18 F] FMISO e [18F] FDG PET / MR. Il nostro interesse risiede nell’imaging metabolico di vari modelli di cancro e malattia per la diagnosi precoce e la valutazione della risposta al trattamento11,13,14,15<sup class…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il sostegno dell’Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) per gli esperimenti di imaging di piccoli animali. Ringraziamo anche il supporto del Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) presso l’Università di Hong Kong per la fornitura di [18 F]FMISO e [18F]FDG.

Materials

0.9% sterile saline BBraun N/A 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade RWD Life Science Co.,ltd S31010-01 Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution Banitore 6.425.678 For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe BD PrecisionGlide N/A 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe Terumo SS05L 5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol Merck 1.07017 For disinfection
Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF2000 For automated cell counting
Buprenorphine HealthDirect N/A Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter) Thermo Scientific 150462 For tumor tissue processing
Centrifuge Sigma 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube Eppendorf EP0030122151 For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Gibco 10566024 high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper RS PRO 841-2518 For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator Techcomp Limited NU5841 For cell culture
Dose calibrator Biodex  N/A Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) Gibco 14287072 For cell wash and injection
Eye lubricant Alcon Duratears  N/A Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS) Gibco A4766801 Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt) RWD Life Science Co.,ltd F12012-10 & F12011-13 Animal surgery tool
Heating pad ALA Scientific Instruments N/A Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe Terumo 10ME2913 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software Mediso Version 3.03 Post-processing and image analysis software
Inverted microscope Yu Lung Scientific Co., Ltd BM-209G For cells morphology visualization
Isoflurane Chanelle Pharma  N/A Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine Alfasan International B.V. HK-37715 Ketamine 10% injection solution, 10 mL 
Medical oxygen Linde HKO 101-HR compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner Mediso  N/A 3 Tesla MR
Needle holder RWD Life Science Co.,ltd F31026-12 Animal surgery tool
Nucline nanoScan software Mediso Version 3.0 Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0) Healthy Medical Company Ltd 000524 & 000526 Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin Gibco 15140122 Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital AlfaMedic 13003 Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors RWD Life Science Co.,ltd S14014-10 Animal surgery tool
Spring Scissors RWD Life Science Co.,ltd S11005-09 Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4% Gibco 15250061 For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. Gibco 25200072 For cell digestion
Xylazine Alfasan International B.V. HK-56179 Xylazine 2% injection solution, 30 mL

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Tan, K. V., Yang, X., Chan, C. Y., Shi, J., Chang, H., Chiu, K. W., Man, K. Non-Invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma. J. Vis. Exp. (186), e63958, doi:10.3791/63958 (2022).

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