Summary

Scaffold 3D macroporosi interconnessi da barre di microgel

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Abstract

Un sistema bicomponente di microgel funzionalizzati dalla microfluidica consente una rapida interconnessione in costrutti macroporosi 3D in soluzioni acquose senza ulteriori additivi. La gelificazione continua su chip fotoavviata consente la variazione del rapporto di aspetto del microgel, che determina le proprietà del blocco di costruzione per i costrutti ottenuti. I monomeri di glicidil metacrilato (GMA) o 2-amminoetilmetacrilato (AMA) vengono copolimerizzati nella rete di microgel basata su polimeri stellari di glicole polietilenico (PEG) per ottenere funzionalità epossidica o amminica. Un flusso di olio di focalizzazione viene introdotto nella struttura di uscita microfluidica per garantire la raccolta continua delle barre di microgel funzionalizzate. Sulla base di una recente pubblicazione, i costrutti basati su aste di microgel producono pori più grandi di diverse centinaia di micrometri e, allo stesso tempo, portano a una maggiore stabilità complessiva dell’impalcatura rispetto a un modello basato su sferica. In questo modo, è possibile produrre costrutti di volume più elevato con più volume libero, riducendo al contempo la quantità di materiale richiesto. Gli scaffold macroporosi interconnessi possono essere prelevati e trasportati senza danni o disintegrazioni. I gruppi amminici ed epossidici non coinvolti nell’interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati indipendentemente per la post-modifica. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per la fabbricazione di barre di microgel per formare scaffold macroporosi interconnessi che possono essere utilizzati per successivi esperimenti cellulari.

Introduction

Per studiare il comportamento complesso delle cellule cooperative nei costrutti 3D, le piattaforme di scaffold devono mostrare prestazioni coerenti in termini di riproducibilità, avere una geometria adatta per la migrazione cellulare e, allo stesso tempo, consentire una certa flessibilità in termini di alterazione dei parametri per indagare la loro influenza sul tessuto vivente1. Negli ultimi anni, il concetto di particelle ricotto macroporose (MAP), descritto per la prima volta da Segura et al., si è sviluppato in una piattaforma efficiente e versatile per la produzione di scaffold 3D2. La composizione su misura dei microgel, che sono gli elementi costitutivi dello scaffold 3D finale, predefinisce proprietà come la rigidità del costrutto, la reattività chimica selettiva della rete di gel e la dimensione finale dei pori dello scaffold 2,3,4,5,6. I peptidi adesivi cellulari come spunti per le interazioni scaffold-cellula sono incorporati nella rete polimerica dei microgel per consentire l’attaccamento cellulare e possono essere variati per studiare i loro effetti specifici sulle cellule in coltura. Gli scaffold 3D sono stabilizzati dall’interconnessione dei microgel iniettabili ricotti a causa di legami covalenti o supramolecolari, risultando in costrutti robusti e definiti per la coltura cellulare 2,3,5,7,8.

La microfluidica si è affermata come uno dei metodi più accurati e adattabili per la preparazione di idrogel granulari definiti9. La possibilità di produrre maggiori quantità degli elementi costitutivi necessari in un processo continuo mantenendo la loro monodispersità chimica, meccanica e fisica contribuisce in modo sostanziale all’idoneità di questo processo. Inoltre, le dimensioni e la forma dei microgel prodotti possono essere manipolate con vari metodi come emulsioni batch, microfluidica, litografia, spruzzatura elettrodinamica o frammentazione meccanica, che determinano la geometria dei blocchi di costruzione e, quindi, la struttura 3D dell’impalcatura finale 1,10.

Recentemente, è stato riportato il concetto di scaffold 3D macroporosi composti da barre di microgel funzionalizzate che si interlegano rapidamente in soluzioni acquose senza ulteriori additivi11. L’anisotropia dei bastoncelli di microgel ha portato a porosità e distribuzioni dei pori più elevate con dimensioni dei pori maggiori rispetto all’impiego di microgel sferici in questo studio11. In questo modo, meno materiale crea pori più grandi con una varietà di geometrie di pori diverse, mantenendo la stabilità dello scaffold 3D. Il sistema è costituito da due tipi di barre di microgel con ammina primaria complementare e gruppi funzionali epossidici che vengono consumati all’interno della reazione di interconnessione quando entrano in contatto tra loro. I gruppi funzionali che non partecipano al processo di interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati per la post-modifica selettiva con peptidi adesivi cellulari o altri fattori bioattivi. Le cellule dei fibroblasti si attaccano, si diffondono e proliferano quando vengono coltivate all’interno degli scaffold 3D, crescendo prima sulla superficie del microgel e riempiendo la maggior parte dei macropori dopo 5 giorni. Uno studio preliminare di co-coltura di fibroblasti umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha mostrato risultati promettenti per la formazione di strutture simili a vasi all’interno degli scaffold 3D interconnessi11.

Protocol

1. Materiale richiesto e preparati per la microfluidica Per la procedura microfluidica descritta, utilizzare siringhe di vetro da 1 mL e 5 mL e pompe a siringa. La formazione di goccioline su chip viene osservata tramite un microscopio invertito dotato di una telecamera ad alta velocità. Creare il progetto del chip microfluidico (Figura 1B) utilizzando un software di progettazione assistita da computer e produrre un modello master come già riportato<sup…

Representative Results

Figura 2: Struttura dello scaffold reticolato macroporoso. (A) Proiezione 3D di una microscopia confocale da 500 μm Z-stack dello scaffold macroporoso interconnesso. La barra di scala rappresenta 500 μm. (B) Impalcatura interconnessa composta da ~ 10.000 barre di microgel su un vetro di copertura prelevato diretta…

Discussion

Uno dei passaggi critici in questo protocollo è la qualità del 2-amminoetilmetacrilato (AMA) utilizzato come comonomero per la funzionalizzazione dell’ammina primaria. L’AMA dovrebbe essere una polvere a grana fine e preferibilmente incolore consegnata in un contenitore di vetro marrone a tenuta di gas. Si dovrebbe evitare l’uso di materiale verdastro e grumoso, in quanto compromette significativamente la reazione di gelificazione e influisce negativamente sulla riproducibilità dei risultati. In caso di scarsa gelific…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esprimiamo la nostra gratitudine ai coautori del nostro precedente lavoro su cui si basa questa metodologia, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born e Tamás Haraszti. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) nell’ambito del progetto B5 e C3 SFB 985 “Microgel funzionali e sistemi di microgel”. Riconosciamo il finanziamento del Comitato per la concorrenza del Senato di Leibniz (SAW) nell’ambito del Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Riconosciamo sinceramente i finanziamenti della Commissione europea (EUSMI, 731019). Questo lavoro è stato svolto in parte presso il Center for Chemical Polymer Technology (CPT), sostenuto dall’UE e dallo Stato federale della Renania settentrionale-Vestfalia (sovvenzione EFRE 30 00 883 02).

Materials

ABIL EM 90 Evonik 144243-53-8 non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride TCI Chemicals A3413 >98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa Biochempeg Scientific Inc. A88009-20K ≥ 95 %
AutoCAD 2019 Autodesk computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG XH49.1 pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass Marienfeld-Superior type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm Electron Microscopy Sciences 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I Sigma-Aldrich 201626
Fluorescein isothiocyanate Thermo Fisher Scientific 46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate Sigma-Aldrich 779342 ≥97.0% (GC)
GRGDS-PC CPC Scientific FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes Thermo Fisher Scientific 10772361/10500052 PFTE Luer-Lock
Hexane Sigma-Aldrich 1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Sigma-Aldrich 900889 ≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope Ted Pella, Inc. 22443-12
Novec 7100 Sigma-Aldrich SHH0002
Oil Red O Sigma-Aldrich O9755
Paraffin VWR Chemicals 24679320
Pavone Nanoindenter Platform Optics11Life
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade dropletex ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol Sigma-Aldrich 190764 ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes Eppendorf 30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium Gibco 11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit Dow SYLGARD 634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane Sigma-Aldrich 448931
UVC LED sterilizing box UVLED Optical Technology Co., Ltd. 9S SZH8-S2

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., De Laporte, L. Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods. J. Vis. Exp. (184), e64010, doi:10.3791/64010 (2022).

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